СОДЕРЖАНИЕ

На правах рукописи






ЧЕРКАСОВ Евгений Геннадьевич






РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО И ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОГО (NAT) МИНИПУЛ- ТЕСТИРОВАНИЯ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ВИЧ, ВИРУСЫ ГЕПАТИТОВ В и С



14.00.29 - гематология и переливание крови







АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук











САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2002
Работа выполнена на станции переливания крови ФУ "Медбиоэкстрем" при Минздраве РФ и в Центральном научно-исследовательском институте трансфузионной медицины и медицинской техники АМТН
Научные руководители:
доктор медицинских наук, академик АМТН И.Б.Сущенко
доктор медицинских наук, профессор Н.А.Фёдоров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ В.А. Аграненко
доктор медицинских наук, профессор В.Н. Чеботкевич
Ведущая организация: Российская военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ

Защита состоится "____" ___________ 2002 г. в ____ час. на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан "___"__________ 2002

Ученый секретарь диссертационного совета,кандидат медицинских наук В.С. Быков

Актуальность проблемы.

Доноры, инфицированные вирусами иммунодефицита человека, гепатитов В, С, но находящиеся в периоде так называемого "сероконверсионного окна", являются серонегативными по данным иммуноферментного анализа, но их кровь содержит высокие концентрации этих вирусов. В связи с этим несколько лет тому назад начато международное сотрудничество по созданию стандартов и разработке технологии NAT (Nucleic Amplification Techniques) для тестирования донорской крови, компонентов и препаратов, получаемых из неё. Методическая база для такого NAT -тестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С на основе отечественных реагентов и аппаратуры была создана в лаборатории генотестирования донорской крови на СПК ФУ "Медбиоэкстрем" и ЦНИИ ТММТ АМТН, но реальная технология и опыт "ИФА- минипул- NAT- тестирования" в России и СНГ до сих пор отсутствовали. Перенос зарубежных коммерческих технологий "ИФА- минипул- NAT- тестирования" в службу крови России пока невозможен как из-за высокой стоимости их, так и по причине отсутствия опыта практического NAT- тестирования крови. Аналогичные трудности существуют и за рубежом, именно поэтому крупные банки крови Европы в своих технологиях используют, так называемые "in-house" тест-системы и национальные стандарты, откалиброванные по международным стандартам. В Японии, Великобритании, Германии, Италии, Канаде,Франции и Австралии "минипул- NAT- тестирование" донорской крови проводится в масштабах целой страны, в крупных центрах лабораторной диагностики, что обеспечивает высокий уровень вирусной безопасности донорской крови.

Цель и задачи исследования.

Учитывая актуальность проблемы обеспечения вирусной безопасности донорской крови, основной целью работы является повышение вирусной безопасности донорской крови, её компонентов и препаратов, выявление бессимптомных серонегативных доноров-вирусоносителей HIV, HCV, HBV и истинных вирусоносителей среди ИФА- положительных доноров.
Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить возможности применения однопробирочного варианта экстракции суммарных РНК и ДНК из пулов плазмы, исключающего их потери и осуществить стадию обратной транскрипции РНК HCV и HIV в той же пробирке после растворения осадка в буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу.
2. Отработать ручной ("десятки-сотни") и автоматический ("8-12-96") с применением самплера фирмы "Гамильтон" варианты подготовки минипулов.
3. Создать компьютерную программу для формирования минипулов плазм донорской крови в формате 96-луночного планшета с применением штрих-кодирования и отработать технологию передачи по компьютерной сети сопроводительной информации (протоколы и файлы) о полученных результатах NAT- тестирования с последующей выбраковкой ИФА-негативных, но NAT-позитивных донаций крови и плазмы.
4. Сопоставить частоту идентифицированных NAT-положительных донаций в минипулах и единичных образцах.
5. Определить частоту выявления NAT-позитивных результатов на РНК HCV и ДНК HBV в группах серонегативных доноров на эти вирусы.
6. Определить частоту выявления NAT-позитивных результатов на РНК HCV и ДНК HBV в группах доноров серопозитивных на HBsAg и антитела к HCV.
7. Разработать программу клинико-лабораторного изучения серонегативных, но NAT-позитивных на HCV и HBV доноров совместно с гепатологическим центром Комитета здравоохранения г. Москвы.

Научная новизна

Аналогичные работы в Российской Федерации и СНГ до настоящего времени не проводились. По сравнению с опубликованными в странах Европы, Японии и США результатами внедрения минипул - NAT - тестирования донорской крови, разработаны оригинальные и более простые методические подходы доступные для небольших станций переливания крови.

Практическая значимость работы

Применение дополнительного NAT-минипул тестирования донорской крови снижает риск посттрансфузионных гепатитов и ВИЧ-инфекции у реципиентов донорской крови, её компонентов и препаратов, позволяет выявить истинных вирусоносителей среди ИФА-положительных доноров и осуществить контроль за карантинизируемой плазмой в случае отсутствия повторного ИФА-анализа.

Реализация результатов работы

Отработана и внедрена в ежедневную практику технология параллельного ИФА и NAT-минипул тестирования донорской крови, заготавливаемой на Станции переливания крови ФУ "Медбиоэкстрем" при Минздраве РФ. В инициативном плане, совместно с Гепатологическим консультативным центром КЗ г. Москвы (руководитель д.м.н., проф. Н.П. Блохина) создана программа "Клинико-лабораторного исследования доноров с положительными результатами ИФА- и ПЦР- анализов на вирусные гепатиты В и С", имеющая целью изучить возможности реабилитации доноров с положительными реакциями ИФА- и ПЦР- анализа на вирусы гепатитов В и С путем комплексного изучения в динамике специфических антител, антигенов, вирусных РНК и ДНК в крови и биоптатах печени, биохимических показателей, функционального состояния печени и клинического статуса. В настоящее время начато формирование трех регистров доноров:
1. С высокими значениями оптической плотности ИФА-анализа на антитела к HCV и HBsAg;
2. Серонегативные в ИФА, но положительные на РНК HCV и ДНК HBV;
3. Положительные как по результатам ИФА, так и по результатам ПЦР.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", 6-8 июня 2000 г., г. Санкт-Петербург; семинаре "Минипул-NAT-тестирование донорской крови на ДНК HBV,РНК HCV и ВИЧ", 2-6 октября 2000 г., г. Москва; научно-практической конференции "Актуальные проблемы трансфузионной медицины", 4-5 октября 2000 г., г. Киров; Всероссийской конференции "Методические и практические аспекты фракционирования донорской крови в лечебной практике и донорстве", 28-29 ноября 2000г., ОАО БФА, г. Москва; симпозиуме "Универсальные технологии для генотестирования биоматериалов", 3-7 декабря 2001г., г. Москва; научно-практической конференции "Современные проблемы гематологии и трансфузиологии", 20-21 февраля 2002 г., г. Киров; VIII съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней", 26-28 марта 2002 г., г. Москва; X Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 26-31 мая 2002 г., С.- Петербург; Юбилейной Российской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", 18-20 июня 2002 г., С.- Петербург.



Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Диссертация изложена на 105 страницах печатного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, указателя литературы, содержащего 48 библиографических источников и двух приложений.

Положения выносимые на защиту

1. Разработанная технология минипул-NAT-тестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С в ручном и полуавтоматичесчком режиме позволяет выявлять в пулах серонегативной плазмы РНК HCV- и ДНК HBV- позитивные донации в пределах известных вариаций в странах Европы.
2. Частота NAT- позитивных донаций на HCV среди первичных доноров на порядок превышает частоту среди серонегативных кадровых доноров плазмы.
3. NAT- тестирование серопозитивных доноров на HCV и HBV позволяет отделить группу не содержащих РНК и ДНК этих вирусов (45-53%).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проводились на образцах плазмы донорской крови, заготавливаемой на СПК ФУ "Медбиоэкстрем" при Минздраве РФ и от кадровых и безвозмездных доноров СПК КЗ г. Москвы.
Наша работа по ПЦР детекции HIV, HBV и HCV в начальной стадии была произведена на пробах, обрабатываемых TRIAZOLом, поскольку такая обработка давала более интенсивные сигналы РТ-ПЦР, но она включает один перенос в процессе экстракции (водной фазы для осаждения нуклеиновых кислот изопропанолом) и использует токсичный реагент - фенол. В связи с этим нами был адаптирован однопробирочный метод выделения нуклеиновых кислот из образцов биоматериалов, разработанный в ЦНИИ ТММТ АМТН (Н.А.Федоров, А.А.Елов, Ю.С.Суханов. Патент № 2134871, приоритет от 01.12.98). Наблюдавшееся при электрофорезе ослабление РТ-ПЦР сигналов по сравнению с теми же самыми образцами, обработанными TRIAZOLом, стало несущественным после применения предподготовки проб посредством центрифугирования и удаления супернатанта и введения дополнительной отмывки осадка нуклеиновых кислот 70% этанолом.
Одна из основных проблем на пути внедрения метода генотестирования связана с выделением РНК и ДНК (НК) любого происхождения в пригодной для ПЦР форме. Эта проблема особенно актуальна для РНК-содержащих структур в связи с нестойкостью РНК из-за рибонуклеазного гидролиза.
Для одновременного выделения вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК лизис биологического материала мы осуществляли раствором 6М NaI, содержащим РНК-носитель, при этом, раствор полученных НК пригоден как для ДНК-ПЦР, так и для РТ-ПЦР.
Полученный осадок суммы ДНК и РНК обрабатывали обратной транскриптазой в буфере, содержащем трифосфаты и антисмысловые праймеры к определяемым РНК. При этом без изоляции РНК получали смесь всех содержащихся в биопробе ДНК и ДНК-копий (кДНК) ПЦР-тестируемых РНК, которая далее вводилась в ПЦР-анализы (Н.А.Федоров, А.А.Елов, Ю.С.Суханов. Патент № 2164532, приоретет от 11.07.2000).
Набор реагентов для высокочувствительного обнаружения РНК и ДНК вирусов при анализе минипулов методом двукратной ПЦР состоял из:
а) раствора для обратной транскрипции, содержащего оптимальный для обратной транскриптазы MuLV солевой буфер без дитиотрейтола, трифосфаты и aнтисмысловые праймеры на ВИЧ и вирус гепатита С (RTB IC);
б) рабочего раствора обратной транскриптазы MuLV в буфере для хранения этого фермента, содержащим дитиотрейтол;
в) растворов реагентов для первой ПЦР - a1-HI для ВИЧ и a1-HC для гепатита С, содержащих трифосфаты, внешние праймеры и ДНК внутреннего контроля в количестве 10 молекул на пробу;
г) растворов реагентов для второй ПЦР - a2-HI для ВИЧ и a2-HC для гепатита С, содержащих трифосфаты и внутренние праймеры;
д) раствора реагентов для однократной ПЦР на вирус гепатита В, содержащего праймеры, трифосфаты и внутренний стандарт в количестве 100 молекул на пробу;
е) двукратного буфера с ферментом Taq-пoлимepазoй (2хБФ);
ж) воды для ПЦР;
з) масла для ПЦР;
и) положительного контроля - раствора РНК или ДНК, содержащего амплифициpyeмый участок.
Для ПЦР-анализа на РНК ВИЧ, РНК вируса гепатита С и ДНК вируса гепатита В использовали осадок НК, полученный по технологии однопробирочного метода. Обратную транскрипцию РНК ВИЧ и вируса гепатита С проводили одновременно с растворением сухого осадка НК. Перечисленные выше реагенты, изготовлены в ЦНИИ ТММТ АМТН по проекту "Ген-гем-тест".
Порядок работы для серии проб минипулов числом n.
1. Готовили раствор для обратной транскрипции путём смешивания реагента RTB IC (буфер, содержащий трифосфаты и aнтисмысловыe праймеры на ВИЧ и вирус гепатита С), воды и реагента RT (рабочий раствор обратной транскриптазы MuLV) в соотношении 15:15:1 в количестве 31x(n+3) мкл. Далее вносили по 30 мкл полученного раствора в пробирки с сухими остатками НК и суспендировали эти осадки на вортексе.
2. Три пробирки на 0,5 мл для контролей маркировали как HIV+ (положительный контроль на ВИЧ), НСV+ (положительный контроль на гепатит С) и K- (Отрицательный контроль) и вносили в эти три пробирки по 30 мкл готового раствора для обратной транскрипции.
3.Добавляли в пробирку HIV+ 3 мкл положительного контроля HIV+, а в пробирку НСV+ - 3 мкл положительного контроля НСV+. В oтрицaтельный контроль (К-) добавляли 3 мкл воды. Кратко центрифугировали все пробирки с пробами и контролями для сбора жидкости на дне и инкубировали их 30 мин. в микротермостате при 42° С для проведения обратной транскрипции.
4. Готовили смеси для ПЦР-обнаружения вирусов.
Для ВИЧ смешивали 5x(n+3) мкл воды, 5х(n+3) мкл реагента а1-HI (раствор, содержащий праймеры, трифосфаты и внутренний стандарт), и 10х(n+3) мкл 2хБФ (двукратный буфер с ферментом Taq-пoлимepазoй), после чего распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 пронумерованных пробирок для ПЦР.
Для вируса гепатита C смешивали 10x(n+3) мкл реагента а1-НС и 10х(n+3) мкл 2хБФ и распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 пpoнумepoвaнных пробирок для ПЦР.
Для вируса гепатита В смешивали 5x(n+3) мкл воды, 5х(n+3) мкл реагента аНВ и 10x(n+3) мкл 2хБФ и также распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 прoнумepoванных пробирок для ПЦР.
5. Добавляли по 2 капли масла во все пробирки для ПЦР.
Пробирки с пробами после обратной транскрипции центрифугировали 1 мин. при 14 000 об/мин. для отделения нерастворившегося осадка. Пробирки с контролями, не содержащие осадка, не центрифугировали.
6. Из пробирок после обратной транскрипции с помощью автоматической микропипетки одноразовыми наконечниками отбирали по 5 мкл прозрачного супернатанта и вносили его под масло в пробирки для ПЦР в следующей последовательности:
7. Вначале раствор из пробирки К- вносили в отрицательные контроли для всех трех вирусов, затем в соответствующие пробирки вносили растворы всех проб после обратной транскрипции и, в последнюю очередь, в пробирки для ПЦР вносили положительные контроли: для ВИЧ и гепатита С - соответственно по 5 мкл растворов из пробирок HIV+ и НСV+ после обратной транскрипции, а для гепатита В -3 мкл контрольного раствора ДНК вируса гепатита В (HBV+). Оставшиеся пробирки со смесью для ПЦР (по одной для каждого вируса) использовали как дополнительные отрицательные контроли, в которые раствор после обратной транскрипции не вносится.
8. Далее кратко центрифугировали все пробирки для разделения слоев и проводили ПЦР по программе 94° С 3 мин; далее 35 циклов: 92° С 30 сек, 55° С 30 сек, 72° С 30 сек, в конце 72° С 3 мин.
9. Смесь после ПЦР для определения вируса гепатита В, для которого достаточно однократной амплификации, анализировали электрофорезом в 2%-ном агарозном геле. Для вируса гепатита С и ВИЧ проводили вторую ПЦР в описанной ниже последовательности:
10. В новых амплификационных пробирках готовили смеси, объемом по 20 мкл каждой путем смешивания 10 мкл 2хБФ и10 мкл реагента а2-НС (для вируса гепатита С) и 10 мкл 2хБФ и 10 мкл реагента a2-HI (для ВИЧ). Затем добавляли масло.
11. Далее из каждой пробирки после первой ПЦР на ВИЧ и вирус гепатита С отбирали по 1,5 мкл реакционной смеси и вносили в соответствующую пробирку для второй ПЦР и проводили вторую ПЦР по программе: 94° С 30 сек; далее 15 циклов: 92° С 30 сек, 60° С 30 сек, 72° С 30 сек, в конце 72° С 3 мин., по окончании которой, анализировали смесь электрофорезом в 2%-ном агарозном геле.
В работе использовали:
1) амплификатор ДНК многоканальный "Терцик" (АО ДНК-Технология, г.Москва);
2) центрифуга "СМ-50" фирмы ELMI, Латвия;
3) трансиллюминатор Biometra TI 1 Германия;
4) Гель-Сканер ГСК -"Шатёр-1000м" ТОО "Дельтатех" научный парк МГУ, г.Москва;
5) Камера для электрофореза ЭФК-140 ТОО "Дельтатех" научный парк МГУ, г.Москва;
6) Микротермостат "Биоком"- TERMO 24-15;
7) Набор автоматических пипеток;
8) Универсальный автоматический комплекс "MICROLAB AT plus 2 / F.A.M.E. фирмы HAMILTON, Щвейцария.

Результаты исследования и их обсуждение

Первый опыт ручного минипул-ПЦР- тестирования донорской крови на HIV, HCV и HBV нами был получен на остатках плазмы, заключенной в трубочках одноразовой системы аппарата Гемонетик, удаляемой в отходы после проведения плазмафереза. Концы таких трубочек отрезали отдельными ножницами, обработанными раствором соляной кислоты, и выдавливали 1 каплю объёмом около 100 мкл в пробирку Эппендорфа для получения минипула от 10 доноров. Как показано на схеме (Рис.1), далее из этих пулов первого порядка путем объединения 100 мкл аликвот формировали пулы второго порядка из нескольких десятков, но не более чем от 100 доноров.

Порядковые номера


1, 2, 3, ...10


По 100 мкл плазмы из каждого образца

11, 12,13,...20


По 100 мкл плазмы из каждого образца




....................
.................................

91, 92, 93,...100


По 100 мкл плазмы из каждого образца

Исходные плазмы
Минипулы первого уровня
Минипулы второго уровня
Рис. 1. Схема приготовления минипулов.

По такой ручной технологии минипул-ПЦР-тестирования были исследованы 8849 донаций серонегативной плазмы, полученной методом плазмафереза в период с сентября 1998 года по апрель 1999 года (Таблица 1).

Таблица 1. ПЦР анализ серонегативных донаций.
Вирус
Положительные сигналы в пулах
Из них не подтвердилось при ретестировании
Выявлено ПЦР-положительных донаций
HBV
5
3
2 (0,023%)
HCV
7
7
0
HIV
0
0
0
Количество серонегативных донаций - 8849
Анализ проводился в составе пулов по 10 донаций.

Далее мы получили возможность готовить минипулы из 8 и 12 донаций плазмы автоматически на самплере фирмы "Гамильтон" с использованием разработанной нами компьютерной программы формирования пулов с применением штрих-кодовой регистрации минипулов и индивидуальных донаций. Этот автомат работает с сериями из 96 проб в формате иммунологического 96-луночного планшета. Пулы из 8 и 12 донаций соответствуют столбцам и строкам микропланшета (Рис.2), а путем объединения аликвот этих минипулов можно создавать пул второго порядка, объединяющий все 96 образцов.. Если последний при ПЦР-анализе даст положительный сигнал, то идентификация вирус-содержащих донаций осуществляется путем ретестирования минипулов из 8 и 12 донаций как это показано на рисунках 2 и 3. Эта донация соответствует пересечению строки и столбца, минипулы которых дают ПЦР-положительные сигналы.




1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
B
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
C
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
D
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
E
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
F
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
G
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
H
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Рис. 2. Идентификация вирус-положительных донаций методом перекрестных промежуточных пулов из 8 и 12 донаций.

Примечание к Рис. 2. Образцы плазмы, обозначенные цифрами 1-96, объединяются по 8 в промежуточные минипулы 1-12 (по столбцам планшета) и по 12 в минипулы A-H (по строкам планшета), и далее получают общий минипул из 96 образцов. На рисунке показан пример идентификации вирус-содержащей донации по результатам ПЦР-анализа, приведенных далее на рис.3. На пересечении столбца 5 и строки D, минипулы котроых дали положительные сигналы, находят донацию 41, которую следует выбраковать. Если будут две ПЦР-позитивные донации, то они дадут два ПЦР-положительных промежуточных пула из 8 донаций и два ПЦР-положительных промежуточных пула из 12 донаций.

Однако на данном этапе при регулярном генотестировании донорской крови мы ограничивались только минипулами из 8 донаций и идентифицировали положительные донации путем ретестирования архивных донаций из 8, как показано на рисунке 4. Такое минипул-NAT-тестирование плазмы на основе полуавтоматической технологии нами проводилось в отношении первичных доноров Станции переливания крови ФУ "Медбиоэкстрем", которые еще не прошли ИФА-скринирование, т.е. не были отведены доноры с ИФА-положительными результатами.


А Б

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 к- к+ А B C D E F G H 96 к- к+



Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа при идентификации донации, содержащей вирус гепатита В, в ПЦР-положительном пуле из 96 образцов.
Примечание к Рис. 3. Были проанализированы минипулы 1-12, собранные по столбцам планшета (А), и минипулы А-Н, собранные по строкам планшета (Б). Положительные сигналы минипулов 5 и D позволяют точно определить инфицированную донацию 5D как показано на рис.2. Проба 96 - повтор анализа общего пула из 96 образцов, к- и к+ - соответственно отрицательный и положительный контроли.


A Б

1 2 3 4 5 к- к+ 1 2 3 4 5 6 7 8 к- к+

Рис. 4. Пример идентификации донации, содержащий вирус гепатита В.
Примечание к Рис. 4. ПЦР-анализ 5 минипулов по 8 проб (А) и последующего разложения минипула, давшего положительный сигнал (Б). В данном примере HBV-положительной оказалась донация 7 первого минипула.

В Таблицах № 2 и № 3 приведены суммированные данные этих исследований. Прежде всего обращаем внимание на факт значительно большей частоты NAT-положительных донаций как в минипулах, так и при ретестировании индивидуальных донаций: она в несколько раз выше для HBV по сравнению с группой серонегативных доноров (Таблица 1). Группа серонегативных доноров в 6 раз более по численности, но не содержит HCV-NAT- положительных образцов. Соответственно, в группе первичных она составляет 0, 69 %, а в группе серонегативных - 0%. Важно провести сопоставление наших данных по первичным донорам (Таблица 2) с данными аналогичного уровня исследованиями 4231 донаций на РНК HCV в Банке Крови Сан-Пауло (Бразилия), и 2578 донаций в Гане. (Allain J. et al 2000)
Таблица 2. ПЦР-анализы первичных доноров на СПК ФУ "Медбиоэкстрем" с 25.10.2000 г. по 26.02.2001 г.
Вирус
Положительные сигналы в пулах
Из них не подтвердилось при идентификации
Выявлено ПЦР-положительных донаций
Из них в составе:


ИФА+
ИФА-



HBV
3
2
1 (0,076%)
1
0
HCV
21
12
9 (0,69%)
7
2
HIV
2
2
0 (0%)
0
0
Общее число вовлеченных в ПЦР донаций - 1308.
Анализ проводился в составе пулов по 8 донаций..


Таблица 3. ПЦР-анализы первичных доноров на СПК ФУ "Медбиоэкстрем" с 01.03.2001 г. по 18.06.2001 г.
Вирус
Положительные сигналы в пулах
Из них не подтвердилось при идентификации
Выявлено ПЦР-положительных донаций
Из них в составе:


ИФА +
ИФА -



HBV
1
0
2 (0,09%)
2
0
HCV
5
2
3 (0,13%)
3
0
HIV
0
0
0 (0%)
0
0
Общее число вовлеченных в ПЦР донаций - 2206.
Анализ проводился в составе пулов по 8 донаций.

Соответственно, выявляемость NAT-позитивных донаций на РНК-HCV составляет 0,69% (СПК ФУ "Медбиоэкстрем"), 0,45% (Банк Крови г. Сан-Пауло, Бразилия) и 0,12% (Гана). Эти цифры одного порядка, но первичные доноры московского региона имеют более высокую частоту.



Реальное минипул-ПЦР-тестирование плазмы крови доноров в микропланшетном формате из 96 образцов.
Формирование минипула из 96 образцов и промежуточных минипулов из 8 и 12 образцов производили на самплере фирмы "Гамильтон". В штативе № 1 из 96 образцов плазмы доноров в положении D9 находилась плазма донора содержащего HBV в концентрации в 10 раз выше, чем международный стандарт (106 копий HBV/мл). В штативах № 2, № 3 и № 4 в положении D9 находились десятикратные разведения этой HBV-содержащей плазмы крови донора (1:10; 1:100 и 1:1000).
Экстракцию ДНК из полученных минипулов производили из 100 мкл как однопробирочным методом, так и щелочным лизисом с последующей нейтрализацией эквимолярным количеством соляной кислоты.
1 2 3 4 к+ к-
0 1:10 1:100 1:1000

Рис. 5. ПЦР-тестирование ДНК HBV в четырех минипулах из 96 образцов, содержащих в положении D9 HBV-позитивную плазму в разведениях 0 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), 1:1000 (4) до ультрацентрифугирования.

На рисунке 5 представлена видеокомпьютерная распечатка электрофореграммы продуктов ПЦР минипулов плазмы из штативов № 1, № 2, № 3, № 4 до ультрацентрифугирования и после выделения однопробирочным методом. Положительный ПЦР сигнал от образца плазмы D9 отчетливо виден в минипулах из 8 и 12 образцов, обработанных однопробирочным методом (рис. 6), но в минипуле из 96 образцов этот сигнал не обнаруживается при однопробирочном методе выделения, но присутствует при обработке щелочным лизисом. Отсутствие ПЦР-сигнала в 96-образцовом минипуле при использовании однопробирочного метода обусловлено не столько большим разбавлением по сравнению с минипулами из 8 и 12 образцов, сколько наличием одного или нескольких образцов плазмы доноров, в которых содержались ингибиторы ПЦР, а в рядах горизонтали (D) и вертикали (9) таких образцов, содержащих ингибиторы ПЦР нет, поэтому эти минипулы были ПЦР-положительными. Косвенным подтверждением этому являются положительные ПЦР-сигналы в 96-образцовом минипуле после обработки щелочным лизисом. Хорошо известно, что 0,1 N NaOH гидролизует все белки и липиды, в том числе и ингибиторы ПЦР.



Промежуточные пулы по 8 образцов (по столбцам):
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 к+ к-


Промежуточные пулы по 12 образцов (по строкам):



A B C D E F G H к- к+


Рис. 6. Идентификация HBV-содержащей плазмы в пуле 1 из 96 образцов.

Четыре 96-образцовых минипула, содержащих HBV-положительную плазму (D9) в разведениях 0, 1:10, 1:100, 1:1000, были подвергнуты ультрацентрифугированию при 48 000 g в течение 1 часа при + 40 С. Полученные плотные осадки обработаны однопробирочным методом и половину полученного раствора НК взяли для постановки ПЦР. Видеокомпьютерное изображение электрофореграмм представлено на рисунке 7.


1 2 3 4 к+ к-
0 1:10 1:100 1:1000

Рис. 7. ПЦР-тестирование ДНК HBV в четырех минипулах из 96 образцов, содержащих в положении D9 HBV-позитивную плазму в разведениях 0 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), 1:1000 (4) после ультрацентрифугирования.

Интенсивный сигнала ПЦР виден в 96-образцовом минипуле №1 и четкий, но менее интенсивный ПЦР-сигнал и в минипуле №2, более слабые, но достоверные сигналы видны и в минипулах №3 и №4. Напомним, что эти же 96-образцовые минипулы до ультрацентрифугирования были ПЦР-отрицательные. На рис. 8 представлены видеокомпьютерные изображения электорфореграмм минипулов из 8 образцов, входящие в 96-образцовые минипулы № 1, № 1, № 3 и № 4. Интенсивный ПЦР-сигнал обнаруживался в минипуле № 1 и далее ослаблялся пропорционально разведению.







1 2 3 4 к+ к-


Рис. 8 Девятые пулы по 8 образцов из 1, 2, 3 и 4 минипулов по 96 образцов, которые HBV-содержащую плазму в положении D9 имеют в разведениях 0, 1:10, 1:100 и 1:1000 соответственно.

Разумеется, это наше первое реальное ПЦР-минипул тестирование донорской плазмы в формате 96-образцового микропланшета, но оно убеждает нас в том, переход от малых минипулов из 8 и 12 образцов к большим минипулам из 96 образцов во избежание получения ложно-отрицательных результатов в силу разбавления, требует концентрации вируса посредством ультрацентрифугирования при 48000 g 1 час. Одновременно с концентрацией вирусов вместе с отбрасыванием надосадочной жидкости удаляются и ингибиторы ПЦР.
Для перехода к пулам из 96 донаций, в соответствии с опытом Германии и других стран Европы, необходимо применить ультрацентрифугирование пулов при 48 000 g в течение одного часа для концентрирования вирусов, а также определять лимит детекции HIV, HCV, и HBV на основе международных стандартов с известной концентрацией этих вирусов.
Технология NAT-тестирования донорской крови позволила выявлять вирус-содержащие донации в серонегативных по антителам к HCV или по HBsAg HBV, и тем самым повысить вирусную безопасность трансфузий. Кроме того, NAT-тестирование серопозитивных донаций по антителам к HCV и по HBsAg HBV позволяет отделить группу людей не содержащих РНК и ДНК этих вирусов. Доля таких серопозитивных доноров составляет около 30% и 70% соответственно, по усредненным литературным данным. Весьма близки к ним наши данные, суммированные в таблице 4, которые показывают, что процент таких доноров, не содержащих РНК HCV и ДНК HBV, составляет около 42% и 55% соответственно.
Таблица 4. ПЦР-анализ серопозитивных донаций.
Вирус
Обследовано серопозитивных донаций
Полученные результаты ПЦР

Положительные
Отрицательные
HBV
20
9 (45%)
11 (55%)
HCV
47
27 (57,5%)
20 (42,5%)

Скорее всего, эти результаты отражают иную частоту инфицированности населения России. Разумеется, эти исследования прежде всего важны для ИФА-серопозитивных доноров на HCV и HBV, т.к. имеют отношение к прогнозу и к возможности реабилитации их. Но, не менее важны и для санитарно-эпидемиологической службы, поскольку распространителями вирусов гепатитов будут только лица, содержащие эти вирусы.
Создание автоматизированной технологии для дополнительного минипул-NAT-тестирования всей донорской крови не только дает более высокую вирусную безопасность для реципиентов, но и позволяет выявлять бессимптомных вирусоносителей среди доноров и других больших контингентов людей (учащиеся, военные, пациенты стационаров, работники общепита и др.). Международный опыт показал, что разработка и внедрение такой технологии требует, прежде всего, наличия международных NAT-стандартов на разные вирусы для определения лимита детекции этих вирусов выраженном в числе копий в 1 мл, что позволяет применять любые NAT тест-системы, в том числе in-house и любые методы генамплификации.
Несмотря на строгий отбор доноров в соответствии со специальными опросниками, скрининг их крови по общепринятым иммунологическим и биохимическим маркерам остаточный риск инфицирования ВИЧ, вирусами гепатитов В и С сохраняется. В основном, он обусловлен донациями, полученными от недавно инфицированных доноров (до сероконверсии). Например, частота HCV-инфицированных производственных пулов серонегативной на антитела к HCV плазмы на1996 год в NIBSC (Англия) составляла 5 %, а в институте П. Эрлиха (Германия)- 39%. В связи с этим, с 1 июля 1999 года в странах Европейского союза NAT-генотестирование пулов плазмы на РНК HCV стало обязательным и гарантируется международными стандартами ВОЗ для определения чувствительности (лимита детекции) в геномэквивалентах вируса в 1 мл.





July, 1999
Introduction of plasma pool testing for HCV RNA

-CPMP/BWP/390/97
-Ph Eur Mon. On Human plasma for fractionation

European Pharmacopoeia (2,6,21,)
"participation in external quality
assessment is an important PCR quality
assurance procedure for each laboratory
and each operator"


W.K. Roth и E. Seifried, (2002) подтвердили ретроспективным анализом отсутствие трансмиссии HCV в течении трёх лет после введения минипул-ПЦР-тестирования в институте Франкфурта на Майне и отсутствие сероконверсии архивных образцов, тестируемых в индивидуальных ПЦР. Сообщение T.J. Legler et al (2000) о том, что тестирование индивидуальных донаций крови на РНК HCV значительно уменьшает остаточный риск HCV- инфицирования по сравнению с минипул- NAT- тестированием, в этой связи является малодоказательным. Вопрос выбора размеров минипулов для NAT-тестирования решается на основе реальной чувствительности (лимита детекции вирусов), которая устанавливается путем тестирования разведений международных стандартов с известной концентрацией HIV, HCV и HBV, концентрирования вирусов в минипуле и определения процента выхода РНК и ДНК в процессе экстракции их из плазмы конкретным методом. В качестве примера можно привести уже упомянутые нами в первой главе данные Японского Красного Креста по минипул-NAT-тестированию донаций крови из 500 и 50 образцов. Поскольку частота NAT-положительных донаций при использовании минипулов из 50 образцов была выше, чем в минипулах из 500 образцов, в настоящее время служба крови Красного Креста Японии проводит NAT-скрининг донорской крови в минипулах из 50 образцов. Такой сравнительный опыт NAT-тестирования донорской крови в минипулах из 4, 8, 10, 12, 16 и 32 образцов был получен и нами. К началу нашей деятельности мы не располагали международными или национальными рабочими стандартами для определения лимита детекции, и мы не имели автоматического самплера для приготовления минипулов из 96 образцов в формате микропланшета. После того, как были созданы международные стандарты на NAT- тестирование HIV, HCV и HBV, появилась реальная возможность осуществить дополнительное NAT- скринирование донорской крови методом минипулов, чтобы уменьшить затраты времени и материалов на тестирование одной донации. В обнаруженном ПЦР-положительном пуле из 96 образцов в микропланшетном формате вирус-содержащая донация определяется путем ретестирования первичных минипулов из 8 и 12 донаций как показано на рис.2 и 3. Однако с учетом небольших объёмов анализируемой донорской крови (в пределах 1000 донаций в месяц) определение вирусов, в основном, проводилось в небольших минипулах из 8 или 10 донаций, как и при исследованиях аналогичного уровня в некоторых зарубежных банках крови. Работа с такими пулами из нескольких образцов целесообразна на первом этапе проведения NAT-тестирования и для СПК, типа нашей, с пропускной способностью около 10000-15000 донаций в год.
Важным этапом организации минипул-NAT-тестирования является обеспечение пулирования плазмы в течение первых суток после получения крови и архивирования исследуемых образцов с целью последующей идентификации NAT-положительных донаций в NAT-положительном минипуле и ретроспективные исследования посттрансфузионных случаев инфицирования реципиентов.
Мы не применяли коммерческие системы для экстракции ДНК и РНК из плазмы или лейкоцитов крови. Наш первый опыт минипул-NAT-тестирования состоялся только благодаря тому, что Н.А. Федоровым и А.А. Ёловым был создан однопробирочный, быстрый способ одновременной экстракции РНК и ДНК с последующей обратной транскрипцией РНК ВИЧ и HCV в полученном осадке НК, что позволило исключить потери их, особенно, очень лабильной РНК. Второй необходимой предпосылкой нашего опыта были in-house ПЦР и РТ-ПЦР тест-системы на ДНК HBV и РНК HIV и HCV, содержащие внутренние стандарты, которые необходимы для исключения ложно-отрицательных результатов NAT-тестирования и для полуколичественной оценки содержания вируса в пробе. Весьма полезной оказались и оригинальная компоновка реагентов в наших ПЦР-тест-системах, поскольку исключена необходимость их хранения в замороженном виде, и получение ПЦР-смесей в пробирке под слоем парафина для проведения ПЦР с горячим стартом. И, наконец, в процессе нашей работы по минипул-NAT-тестированию была апробирована оригинальная видеокомпьютерная установка "Шатёр" для регистрации полученных методом электрофорезной детекции продуктов ПЦР, созданная А.В. Виноградовым и соавт. (ТОО "Дельта-Тех").
Более 8 000 донаций, исследованные нами методом минипул-NAT-тестирования получены от кадровых доноров плазмы были серонегативные. Вторая группа, более 3 500 донаций, получены от первичных доноров, и ПЦР- и ИФА- тестирование проводили одновременно. В свете наших и литературных данных, частота вирусных маркеров среди первичных доноров, в среднем, на порядок выше, чем среди кадровых серонегативных доноров. Сравнение процента РНК HCV- и ДНК HBV-положительных в этих двух группах доноров показывает, что среди серонегативных доноров было 0, 023% HBV и 0,00% HCV-положительных, подтвержденных при ПЦР-тестировании индивидуальных донаций, а среди первичных доноров было 0, 076-0,09% HBV- и 0,13-0,69% HCV-положительных, подтвержденных при ПЦР-тестировании индивидуальных донаций. Важно отметить, что группа серонегативных доноров в 2,5 раза больше по численности, чем группа первичных доноров, но, тем не менее, среди неё не выявлено ни одной HCV-положительной донации. Такая низкая частота хорошо согласуется с аналогичной частотой среди серонегативных доноров по данным литературы.
На СПК ФУ "Медбиоэкстрем" в инициативном плане совместно с Гепатологическим консультативным центром КЗ г. Москвы (руководитель д.м.н., проф. Н.П. Блохина) создана программа "Клинико-лабораторного исследования доноров с положительными результатами ИФА- и ПЦР- анализов на вирусные гепатиты В и С", имеющая целью изучить возможности реабилитации доноров с положительными реакциями ИФА, но отрицательными результатами ПЦР- анализа на вирусы гепатитов В и С путем комплексного изучения в динамике специфических антител, антигенов, вирусных РНК и ДНК в крови и биоптатах печени, биохимических показателей, функционального состояния печени и клинического статуса. В настоящее время начато формирование трех регистров доноров: с высокими значениями оптической плотности ИФА-анализа на антитела к HCV и HbsAg; серонегативные в ИФА, но положительные на РНК HCV и ДНК HBV; положительные как по результатам ИФА, так и по результатам ПЦР.
По-видимому, лица, серопозитивные, но не содержащие самих вирусов, имеют большую вероятность благоприятных исходов инфекций HCV и HBV. Весьма интересен в этом смысле факт, что уровни АЛТ у HCV ИФА- и ПЦР-положительных доноров были достоверно, в среднем в 3 раза, выше по сравнению с донорами ИФА- позитивными, но ПЦР- отрицательными на РНК HCV (W. K. Roth et al., 2001)





ВЫВОДЫ

1. Первый российский опыт дополнительного минипул-NAT-тестирования донорской крови на основе отечественных in-house ПЦР тест-систем на РНК HIV, HCV и ДНК HBV дал результаты аналогичные тем, которые были получены при ручном тестировании в других странах.
2. Частота ПЦР-негативных доноров среди ИФА-положительных составила 45-57 %, что также находится в пределах известных вариаций.
3. Центрифугирование минипулов при 48 000 g 1 час концентрирует вирус в осадок и снижает эффект разведения при формировании минипулов.
4. Частота ПЦР-положительных донаций среди первичных доноров на HCV на порядок превышает частоту среди серонегативных кадровых доноров плазмы.
5. Аналогичный международным NAT-стандарт на HBV, созданный на основе калибровки HBV-положительной плазмы доноров путем последовательных разведений, стабилен в течение нескольких недель в жидком состоянии, и сохраняет исходный уровень при - 200 С в течение нескольких месяцев.
6. NAT-тестирование ИФА-позитивных доноров позволяет отделять истинных вирусоносителей, что необходимо для проведения эпидемиологических и лечебно-профилактических мероприятий.
7. Инициирована первая российская программа "Клинико-лабораторного исследования доноров с положительными результатами ИФА- и ПЦР- анализов на вирусные гепатиты В и С" совместно с Гепатологическим Консультативным Центром КЗ г. Москвы. (Руководитель-профессор Н.П. Блохина)

Публикации по теме диссертации

1. Стандартизация методов генной амплификации и минипул - ПЦР - генотестирование донорской крови, её компонентов и препаратов плазмы на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С и ЦМВ// Материалы научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 года, с. 237-238 (соавт.: Н.А. Федоров, А.А. Елов, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
2. Повышение вирусной безопасности донорской крови на основе генотестирования// Всероссийская конференция "Методические и практические аспекты фракционирования донорской крови в лечебной практике и донорстве", г. Москва, ОАО БФА, 28-29 ноября 2000 г. (соавт.: Н.А. Федоров, А.А. Елов, Ю.С. Суханов)
3. Новые факты об отсутствии клинических симптомов заболеваний у молодых людей, инфицированных вирусами гепатита С// Вестник службы крови России, № 2, май, 2001, с. 37-38 (соавт.: Н.А. Федоров, Е.Н.Федоров, А.А. Елов, Н.П. Блохина, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
4. Новые данные об отсутствии прогрессирования инфицирования вирусами гепатита С у здоровых молодых людей// Российские медицинские вести, № 2, 2001, с.16-17. (соавт.: Н.А. Федоров, Е.Н.Федоров, А.А. Елов, Н.П. Блохина, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
5. Первый Российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-NAT-тестирования донорской крови на HIV, HCV, HBV// Вестник службы крови России, № 4, 2001 (соавт.: Н.А. Федоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
6. ПЦР-скринирование донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С методом минипулов// Трансфузиология, № 4, 2001 (соавт.: Н.А. Федоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
7. Универсальные технологии для ПЦР- генотестирования крови и других биоматериалов// Сборник трудов научно-практической конференции "Современные проблемы гематологии и трансфузиологии", 2-4 февраля 2002 г. Г. Киров (соавт.: А.А. Елов, Н.А. Федоров, Е.Н. Федоров, Ю.С. Суханов, И.Б. Сущенко)
8. Разработка технологии параллельного ИФА- и минипул- NAT- тестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С// Материалы VIII съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней", 26-28 марта 2002 г., г. Москва (соавт.: А.А. Ёлов, И.Б. Сущенко, Н.А. Фёдоров)
9. Разработка технологии параллельного ИФА- и минипул- NAT- тестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, т.6, №1, 2002, С-Петербург, с. 129 (соавт.: А.А. Ёлов, И.Б. Сущенко, Н.А. Фёдоров)

Список сокращений:

ALT
- аланин-аминотрансфераза
Anti-HBc
- антитела к ядерному антигену вируса гепатита В
Anti-HBs
- антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В
EPFA
- Европейская Ассоциация фракционирования плазмы
FDA
- организация по контролю за лекарственными препаратами и пищевыми продуктами США
JRC
- Японский Красный Крест
HBsAg
- поверхностный антиген вируса гепатита В
HBV
- вирус гепатита В
HCV
- вирус гепатита С
HIV
- вирус иммунодефицита человека
In house
- тест-системы изготовленные в лаборатории
IVIG
- препараты иммуноглобулинов
NASBA
- амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (аналог амплификации, опосредованной транскрипцией)
NAT
- технологии анализов, основанные на амплификации нуклеиновых кислот
Q-FFP
- плазма подвергнутая карантинизации
SoGAT
- Международная рабочая группа по стандартизации генамплификационных методов исследования
TMA
- амплификация, опосредованная транскрипцией
WHO
- Всемирная организация здравоохранения
Бранч-DNA
- гибридизационный анализ с использованием разветвленных ДНК-зондов
ДНК
- дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА
- иммуноферментный анализ
НК
- нуклеиновая кислота
ПЦР
- полимеразная цепная реакция
РНК
- рибонуклеиновая кислота
РТ-ПЦР
- полимеразная цепная реакция с предварительной обратной транскрипцией рибонуклеиновой кислоты

??

??

??

??




1


24




СОДЕРЖАНИЕ