СОДЕРЖАНИЕ



На правах рукописи


Потапов Иван Викторович


ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕТАЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
В КРИОПОВРЕЖДЕННЫЙ МИОКАРД


14.00.41.- ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ И ИСКУССТВЕННЫЕ ОРГАНЫ



АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук





МОСКВА 2003 г.

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт
Трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Академик РАН и РАМН,
доктор медицинских наук, профессор В.И. Шумаков

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:
Доктор медицинских наук, профессор Н.А. Онищенко

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор медицинских наук, профессор Э.Н. Казаков
Доктор биологических наук, профессор М.Г. Пшенникова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
ГУ Научно-исследовательский институт
физико-химической медицины МЗ РФ


Защита диссертации состоится 29 сентября 2003 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-208.055.01. при ГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат разослан "___" августа 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д-208.055.01.
доктор медицинских наук, профессор О.П. Шевченко

Актуальность темы.
Болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, так как количество таких больных не только достаточно велико, но и продолжает увеличиваться. Так, в Государственном докладе о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2001 году указано, что общая заболеваемость взрослого населения РФ болезнями системы кровообращения составила 18312.4 на 100 000 населения, что на 5% выше, чем в 2000 году, а впервые выявленная заболеваемость по сравнению с 2000 годом возросла на 5.2%.
Для лечения болезней сердца в настоящее время используют широкий спектр лекарственных препаратов и немедикаментозных методов, таких как коронарное шунтирование, кардиомиопластика, искусственное сердце, трансплантация сердца и др. (В.И. Шумаков, 2002). Однако, частота развития и распространенность сердечной недостаточности в человеческой популяции продолжает расти. Именно поэтому существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции сердечной недостаточности.
Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделало клетку не только главным объектом воздействий, но и средством лечения многих заболеваний. Так, для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы (В.И. Шумаков, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение донорских гепатоцитов и спленоцитов (Demetriou, 1995), клеточная терапия используется для лечения ожогов (Д.С. Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшенна (В.С. Репин, 1998) и т.д. Однако, возможности клеточных технологий в кардиологии остаются малоизученными и нереализованными.
В последние годы было показано положительное влияние трансплантации клеток различных фенотипов при экспериментальных моделях некроза миокарда или кардиомиопатии. Материалом для пересадки служили аллогенные фетальные кардиомиоциты (Koh, 1995; Li, 1996), фибробласты (Salvatori, 1995), аутологичные скелетные миобласты (Chiu, 1995; Reinecke, 2000), мезенхимальные стволовые клетки (МСК) (Wang, 2000), гладкомышечные клетки (Yoo, 2000), ген-трансфецированные клетки (Soonpaa, 1994; Toma, 1999). Показано, что пересаженные в миокард клетки образуют контакты с КМЦ хозяина (Matsushita, 1999; Yoon, 1995), могут дифференцироваться в фенотип КМЦ in vivo (Chiu, 1995; Wang, 2000), стимулируют ангионеогенез (Tomita, 1999; Li, 1996) и переживают после трансплантации до 6 месяцев (Li, 1997).
Эти исследования позволили начать изучение эффективности метода клеточной трансплантации в клинике. Недавно появились сообщения о положительном влиянии пересадки аутологичных клеток костного мозга в инфаркт-связанную артерию (Assmus, 2002; Strouer, 2002).
Исследования в области клеточных биотехнологий и особенно клеточной терапии находятся на начальном этапе своего развития; в литературе нами не найдено данных о сравнительном анализе влияния трансплантации клеток различного фенотипа на сократительную способность поврежденного миокарда. В частности, нет данных о сравнении эффективности трансплантации фетальных кардиомиоцитов, использование которых сталкивается с труднопреодолимыми юридическими и этическими проблемами, и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые сравнительно доступны, но для которых еще убедительно не показана способность дифференцироваться в клетки мышечного типа и влиять на сократительные свойства поврежденного миокарда. Не проведена также количественная оценка изменений показателей насосной функции сердца после применения методов клеточной трансплантации в условиях последовательного применения нагрузочных режимов и отсутствует сопоставление этих данных с изменениями ультраструктуры поврежденного миокарда.
Отсутствие этих данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы
Изучить и количественно оценить эффективность интрамиокардиальной трансплантации аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга для коррекции сердечной недостаточности в экспериментах на животных.

Задачи работы
1. Воспроизвести модель сердечной недостаточности путем создания стандартно одинаковой зоны повреждения миокарда методом криодеструкции.
2. Отработать технологию выделения и получить культуру фетальных кардиомиоцитов для интрамиокардиальной аллотрансплантации.
3. Отработать технику выделения мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток из костного мозга и осуществить их дифференцировку в кардиомиоцитоподобные клетки для интрамиокардиальной аутотрансплантации.
4. Дать количественную оценку изменений сократительной функции миокарда после криодеструкции, а также после трансплантации в принекротическую зону миокарда фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
5. Установить связь изменений, возникающих в сократительной функции функции поврежденного миокарда, с сохранением функциональной активности клеток, трансплантированных в миокард.
6. Сравнить электронно-микроскопическую характеристику принекротической зоны без и после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предиференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Научная новизна
Впервые в России воспроизведена методика получения мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток из костного мозга и показана возможность их направленной дифференцировки в кардиомиоцитоподобные клетки (гистохимическое окрашивание на кардиоспецифический белок - тропонин I) путем культивирования в питательной среде с временным добавлением 5-азацитидина и постоянным присутствием с ней фактора роста фибробластов b. Новым является то, что по мере увеличения срока культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток в культуре увеличивается и достигает к 4-й неделе 40-45% от общего количества клеток в культуре, что больше, чем у зарубежных авторов (Makino, 1999). Впервые в России нами установлено, что к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), напоминающие миотрубочки, которые обладают способностью спонтанно и ритмично сокращаться; электронно-микроскопически кардиомиоцитоподобные клетки идентифицированы как клетки миобластоидного ряда.
На стендовой установке по Neely на изолированных сердцах нами впервые проведена количественная оценка состояния насосной функции сердца после криодеструкции миокарда, а также после трансплантации в принекротическую зону аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга. Оригинальными являются разработанные нами режимы применения нагрузочных тестов (последовательное повышение дозированных пред- и постнагрузок на левый желудочек) в стендовых условиях, которые использованы для выявления возникающей левожелудочковой недостаточности в криоповрежденных сердцах и констатации повышения устойчивости этих сердец к воздействию этих нагрузок через 3 недели после трансплантации аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга.
Впервые нами установлено, что фетальные кардиомиоциты и мезенхимальные стволовые клетки повышают систолическую функцию левого желудочка при повышении преднагрузок; трансплантация мезенхимальных стволовых клеток повышает устойчивость миокарда и к воздействию постнагрузок. Высказано предположение, что сниженная толерантность сердец к постнагрузкам после трансплантации фетальных кардиомиоцитов обусловлена цитотоксическим действием на миокард длительно используемого циклоспорина А.
С помощью рекомбинантного адновирусного вектора (содержащего Lac-Z-ген E.Coli), внедренного в фетальные кардиомиоциты и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие и функционирование трансплантированных клеток в принекротической зоне в сроках не менее 3 недель; этого в отечественных работах ранее показано не было.
Впервые получены электронно-микроскопические доказательства сужения зоны принекротического повреждения миокарда при трансплантации обоих типов клеточных культур.

Практическая значимость работы
Отработаны режимы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцитоподобные клетки. Предложено для трансплантации в миокард использовать короткие (не более 2-х недель) сроки предифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (после предварительной обработки их 5-азацитидином и культивировании в присутствии фактора роста фибробластов) для осуществления этими клетками морфорегулирующей функций в условиях адекватного микроокружения после трансплантации.
Показано, что клетки, введенные в миокард, продолжают оставаться в нем и функционировать по крайней мере в течение 3-х недель. Доказано положительное влияние трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на насосную функцию сердца после моделирования сердечной недостаточности методом криодеструкции.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 20 июня 2003 года на межлабораторной конференции в ГУ НИИ Трансплантологии и Искусственных органов МЗ РФ.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на конференции "Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)" (Москва, июнь 2002 г.), на II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002 г.), на конференции "Клеточные технологии - медицине" (Москва, май 2003 г.).
По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 в центральной печати, 1 работа опубликована за рубежом.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), характеристики экспериментального материала и методов исследования (глава 2), 2-х глав собственных исследований (главы 3 и 4), обсуждения полученных результатов (глава 5) и заключения, выводов и практических рекомендаций. Указатель использованной литературы включает _____ источников, из которых ___ отечественных и ___ зарубежных. Работа изложена на _____ страницах печатного текста, содержит 6 таблиц и 16 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Работа выполнена на 322 крысах линии Вистар (247 самцов и 75 беременных самок) массой 200-250 г и состоит из 3-х основных частей. В I части работы проводили отработку методик получения первичных культур фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ) и предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток (ПМСК) костного мозга (КМ), а также изучение характеристик этих клеток; отработку методики моделирования сердечной недостаточности (СН) путем осущствления зональной криодеструкции (КД) миокарда (М) левого желудочка (ЛЖ); подбор режимов перфузии изолированных сердец, отработку методик мечения клеток и их идентификации в миокарде после трансплантации (ТП). Во II части работы получали первичные культуры аллогенных ФКМЦ и аутологичных МСК КМ, изучали их свойства, готовили культуры к трансплантации. В III части готовые культуры аллогенных ФКМЦ и предифференцированых МСК (ПМСК) КМ использовали для изучения их влияния на восстановительные процессы в миокарде крыс после моделирования СН методом криодеструкции. Общее количество использованных животных и распределение их по отдельным сериям экспериментов представлены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что в III части работы животные были распределены на 4 группы: группа 1 - ложнооперированные крысы; в группах 2, 3 и 4 у животных моделировали СН методом криодеструкции, и через 7 суток в принекротическую зону животным группы 2 инъекционно вводили раствор Хэнкса (контроль повреждения), животным группы 3 - взвесь аллогенных ФКМЦ (среднее количество 1.15±0.59 млн. клеток в растворе Хэнкса), группе 4 - аутологичные ПМСК КМ (среднее количество 1.49±0.93 млн. клеток в растворе Хэнкса, p=0.129 по сравнению со средним количеством ФКМЦ). Объем инъекционной среды во всех опытах составлял 100-120 мкл. Животные в группе 3 после трансплантации получали циклоспорин в дозе 5 мг/(кг*сут).


Таблица 1. Общее количество использованных животных и распределение их по экспериментальным группам.
Разделы работ
Название работ
Животные
Количество (из них в стат. обработке)
I
Отработка методик
Получение первичных культур ФКМЦ, определение тропонина I в культуре ФКМЦ
Беременные крысы Вистар
17
Получение и ведение первичных культур МСК КМ, предифференцировка МСК КМ, определение тропонина I в культуре МСК КМ
Крысы-самцы Вистар
21
Моделирование СН методом КД
Крысы-самцы Вистар
26
Подбор режимов перфузии изолированных сердец
Крысы-самцы Вистар
35
Мечение клеток в культуре и идентификация их после ТП в М
Крысы-самцы Вистар
8
II
Культуральные исследования
Получение культур аллогенных ФКМЦ, изучение их свойств и подготовка к ТП
Беременные крысы Вистар
58
Получение и ведение культур аутологичных МСК КМ, изучение их свойств и подготовка к ТП
Крысы-самцы Вистар
33
III
Изучение влияния ФКМЦ и ПМСК КМ на М после КД
Группа 1. Ложнооперированные (интактные сердца).
Крысы-самцы Вистар
24 (21 и 31)
Группа 2. Моделирование СН методом КД
Крысы-самцы Вистар
342 (18 и 42)
Группа 3. Моделирование СН методом КД и ТП ФКМЦ
Крысы-самцы Вистар
363 (12)
Группа 4. Моделирование СН методом КД и ТП ПМСК КМ
Крысы-самцы Вистар
303 (12)
Всего
322 (70)

Выживших животных каждой группы выводили из эксперимента спустя 4 недели после криодеструкции для изучения состояния сократительной функции миокарда и для проведения иммуногистохимического, морфометрического и электронно-микроскопического исследований.
Криодеструкцию производили наркотизированным (кетамин 50 мг/кг и ксилазолин 10 мг/кг) интубированным крысам через торакотомный доступ металлическим стержнем диаметром 6 мм, охлажденным в жидком азоте, прикладывая его к переднебоковой стенке ЛЖ на 30 секунд; после оттаивания миокарда криовоздействие повторяли 14 раз.
1. Культуральные методы и методы исследования клеточных культур.
Работа по выделению клеток и их культивированию проводилась в соответствии с общими принципами осуществления культуральных исследований.
Культуры ФКМЦ получали ферментативным методом, описанным Li, (1993) из сердец плодов беременных крыс линии Вистар. ФКМЦ культивировали в среде IMDM ("Gibco", Великобритания), содержащей дополнительно 10% бычьей фетальной сыворотки ("Hyclone", USA), инсулин 0.4 мкМ/л, дексаметазон 10 нМ/л. Для трансплантации использовали 2-дневную культуру ФКМЦ, полученную из 15-20 эмбриональных сердец.
Культуры МСК получали путем культивирования клеток КМ из большеберцовых костей (Caplan, 1991), при этом неприкрепившиеся клетки элиминировали во время смены среды, пластик-адгезивные клетки (МСК) использовали для дальнейшей работы. На 3-и сутки культивирования МСК стимулировали к дифференцировке добавлением в культуральную среду 5-азацитидина в концентрации 6 мкМ/л на 24 часа (Tomita, 1999); после этого среду заменяли на среду IMDM ("Gibco", Великобритания), содержащую дополнительно 10% бычьей фетальной сыворотки ("Hyclone", USA), инсулин 0.4 мкМ/л, дексаметазон 10 нМ/л и фактор роста фибробластов b (FGFb) ("Sigma", USA) в концентрации 20 нг/мл. Среду заменяли через каждые 3 суток. Через 2-3 недели культивирования материал был готов для трансплантации животным. Удлинение сроков культивирования (до 4-6 недель) предпринималось нами для выявления состоявшейся в культуре предифференцировки МСК КМ в кардиомиоцитоподобные клетки.
Для исследования принадлежности клеток, полученных из плодов крыс, к дифференцированным КМЦ и для подтверждения состоявшейся предифференцировки МСК в кардиомиоцитоподобные клетки использовали иммуногистохимический метод идентификации в культурах этих клеток кардиоспецифического белка - тропонина I с помощью мышиных моноклональных антител (антитела были любезно предоставлены А.Г. Катрухой - сотрудником проблемной лаборатории химии ферментов, биофак, МГУ, Москва). Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию проводили на микроскопах "Axiovert 25" ("Karl Zeiss", Германия) "Laborux" ("Leika", Германия). Для фотографирования использовали цветную негативную фотопленку "Fujicolor", Япония и цифровую фотокамеру "Axiocam color" ("Karl Zeiss", Германия).
Для идентификации трансплантированных клеток и определения их месторасположения в миокарде после трансплантации использовали метод Wakitani (1995) прижизненного введения кодирующей метки в клеточную культуру. Введение метки в культуры ФКМЦ и ПМСК перед трансплантацией проводили с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген Lac-Z из E.Coli, кодирующего бактериальную ?-галактозидазу, активность которой в клетках выявляется гистохимически по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата X-Gal. Микроскопию препаратов проовдили на микроскопе "Axiovert 25" ("Karl Zeiss", Германия), для фотографирования использовали цифровую фотокамеру "Axiocam color" ("Karl Zeiss", Германия).
2. Методы оценки морфофункционального состояния сердца после криодеструкции и трансплантации клеток в принекротическую зону миокарда.
Морфометрию макропрепаратов сердца проводили у крыс с интактными сердцами (группа 1) и у крыс через 4 недели после криодеструкции (группа 2). Сердца препарировали по методике раздельного взвешивания, описанной в методических рекомендациях "Патологоанатомическая оценка массы сердца по данным раздельного взвешивания его частей", сост. АМ Лифшиц, 1979 г. Сравнивали: относительные массы свободной стенки левого желудочка (ЛЖ), массы ЛЖ, площади поверхностей свободной стенки ЛЖ; определяли площадь рубцовой ткани после криодеструкции и ее процент от общей площади свободной стенки ЛЖ ср стороны эпикарда и эндокарда. Фотографирование макропрепаратов сердца проводили с помощью цифровой камеры "WebCam PRO eX" ("Creative", Ирландия). Полученные снимки обрабатывали в программе "AutoCad".
Оценку насосной функции ЛЖ проводили в стендовых условиях по модифицированной методике Neely (Neely, 1967), которая позволяет на изолированном сердце количественно регистрировать аортальный, коронарный, минутный объемы (АО, КО, МО) перфузионного раствора (ПР), ЧСС, систолическое, диастолическое давления (СД, ДД) в устье аорты, а также рассчитывать ударный объем ПР (УО), долю АО в МО, развиваемое давление (РД=СД-ДД), время систолы, скорость нарастания давления во время систолы (dP/dt). При этом имеется возможность менять нагрузки на ЛЖ.
Таблица 2. Режимы нагрузочных тестов, использованных для оценки насосной функции изолированных сердец в стендовых условиях.
Режим
Преднагрузка,
см.вод.ст.
Постнагрузка,
см.вод.ст.
Диаметр аортальной трубки, мм
1
10
70
3
2
20
70
3
3
30
70
3
4
30
100
3
5
30
125
3
6
30
100
1.1
7
30
125
3
8
30
?
0
Для количественной оценки степени выраженности СН мы проводили последовательную смену 8 режимов нагрузки на ЛЖ (таблица 2), осуществляемых за 40-45 минут стабильной работы изолированных сердец. Исследование насосной функции сердец начинали через 10-15 минут предварительной перфузии, после чего переходили к постепенному увеличению преднагрузки на ЛЖ (режимы 1-3) путем увеличения притока ПР в левое предсердие (нагрузка объемом) за счет подъема уровня предсердной камеры с 10 до 20 и 30 см. Затем постепенно повышали постнагрузку на ЛЖ (режимы 3-5), увеличивая высоту столба ПР в аортальной трубке диаметром 3 мм с 70 до 100 и 125 см. В режиме 6 увеличивали постнагрузку на ЛЖ, повышая сопротивление аортальному выбросу сердца за счет переключения аортального потока ПР из аортальной трубки с диаметром 3 мм в трубку с диаметром 1.1 мм при высоте столба ПР в аортальной трубке 100 см. В режиме 7, повторяющем режим 5, оценивали способность ЛЖ к восстановлению показателей насосной функции после режима 6. В режиме 8 выход из аорты полностью пережимали на 10 секунд, получая данные о максимальном систолическом, диастолическом и развиваемом давлениях в устье аорты.
Электронно-микроскопическое исследование проводили на биоптатах сердец после оценки их функции в стендовых условиях. Иссекали блок ткани, захватывающий всю толщу миокарда размером 1х6 мм и включающий в себя рубцовую зону длиной 2 мм (зона 1), околорубцовую зону длиной 2 мм (зона 2) и зону дистальнее околорубцовой длиной 2 мм (зона 3). Электронно-микроскопическому исследованию подвергали также 6-недельную культуру ПМСК КМ. Материал готовили по методике Jennings (1981): проводили фиксацию сначала в глютаровом альдегиде, затем в растворе четырехокиси осмия и обезвоживали спиртом восходящей крепости и ацетоном. Блоки заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы исследовали на микроскопе JEM-100B ("JEOL", Япония).
Статистическую обработку результатов исследования производили с использованием методов вариационной статистики, используя t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений при вероятности ошибки I рода p=0.05. В обработке материала применяли программы Excell пакета MS Office и Biostat 4.03.


Считаю необходимым отметить, что в освоении методик, использованных в данной работе, автору помогали сотрудники лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. лаб. д.м.н. профессор Н.А. Онищенко): культуральные исследования были проведены под руководством научного сотрудника М.Е. Крашенинникова; изучение функции изолированных сердец проводилось совместно с к.б.н. Л.В. Башкиной; гистохимические исследования были осуществлены при непосредственном участии к.м.н. В.А. Зайденова. Электронно-микроскопические исследования были проведены при участии старшего научного сотрудника лаборатории клинической патоморфологии к.м.н. В.В. Северина (зав. лаб. д.м.н. профессор И.М. Ильинский). Содействие в обеспечении и содержании экспериментальных животных оказывал зав. виварием П.В. Аврамов. Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

Результаты исследования
1. Характеристика клеточных культур, используемых для интрамиокардиальной трансплантации. Доказательства предифференцировки МСК КМ в кардиомиоцитоподобные клетки.
Для профилактики и лечения СН вследствие развивающегося в сердце дефицита мышечной ткани важно, с одной стороны, ослабить процесс формирования рубцовой ткани в зоне повреждения, а с другой - способствовать восстановлению мышечной массы. В своей работе мы исходили из того, что фибробласты и и кардиомиоциты имеют мезенхимальное происхождение и в своем эмбрио- и гистогенезе имеют общих проедшественников. Поэтому мы поставили задачу отработать технологию предифференцировки МСК КМ в кардиомиоцитоподобные клетки для стимуляции развития мышечной ткани после их трансплантаци. Для доказательтства предифференцировки мы использовали гистохимические окраски клеточных культур, сопоставляя их с окраской и использованием ФКМЦ, которые, как известно, уже дифференцированы в кардиомиоцитарном направлении.
Мы установили, что культура ФКМЦ уже на 2 сутки культивирования формирует монослой спонтанно, ритмично и синхронно сокращающихся клеток. Иммунофлуоресцентное исследование с мышиными моноклональными антителами к тропонину I подтвердило, что практически все клетки в культуре ФКМЦ содержат кардиоспецифический белок тропонин I. Культура МСК КМ через неделю культивирования представляла собой монослой фибробластоподобных МСК. На 2-й неделе в культуре МСК мы наблюдали появление продольных кардиомиоцитоподобных клеток (1-2%). К концу 3-й - началу 4-й недели эти клетки содержали от 1 до нескольких ядер и спонтанно сокращались. При пересеве культур многоядерность клеток и спонтанное сокращение пропадали и появлялись вновь только после образования монослоя фибробластоподобных клеток.
Иммуногистохимическая идентификация присутствия в этих клетках кардиоспецифического белка тропонина I подтвердила, что к концу 3-й - началу 4-й недели культивирования количество тропонин I-положительных клеток достигает 35-45%, что выше, чем в исследованиях зарубежных авторов (Makino, 1999).
Осуществление в процессе культивирования предифференцировки МСК в кардиомиоцитарном направлении подтверждают и результаты электронно-микроскопического исследования этих клеток. Наличие большого ядра и большого количества неорганизованных волокон в цитоплазме позволяет отнести эти клетки к слабодифференциванным клеткам миобластоидного ряда.
Культивирование МСК, обработанных 5-азацитидином, в 0,2% агаризованной среде приводило к прекращению их роста и постепенной элиминации, что косвенно свидетельствует об отсутствии у МСК малигнизирующей активности и следовательно о безопасности их применения.
Таким образом, отработка методов культивирования ФКМЦ и МСК позволили нам убедиться в том, что in vitro мы получаем культуры дифференцированных ФКМЦ и культуры МСК, предифференцированных в кардиомиогенном направлении, которые безопасны для применения. Это давало нам основание считать, что при введении ФКМЦ и ПМСК в принекротическую зону миокарда эти клетки будут способны оказывать регулирующее воздействие на восстановление структуры и функции поврежденного миокарда.
2. Оценка функционального и морфологического состояния сердец после криодеструкции и трансплантации в принекротическую зону ФКМЦ и ПМСК.
Моделируя СН методом криодеструкции, мы установили, что на 30 сутки в зоне повреждения ЛЖ идет формирование рубцовой ткани округлой формы диаметром 6-7 мм. со стороны эпикарда и 3 мм. со стороны эндокарда; толщина стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1 мм. Нами не было отмечено различий в размерах и форме рубца у животных 2, 3 и 4 групп, но были выявлены достоверные различия в относительной массе свободной стенки ЛЖ и относительной массе ЛЖ между 2 группой с криодеструкцией и 1 группой у животных с интактными сердцами (таблица 3).
Таблица 3. Сравнение массы интактных сердец и сердец после криодеструкции.
Масса животного, г
Масса свободной стенки ЛЖ, (мг) / масса животного (г)
Масса ЛЖ (мг) / масса животного (г)
Интакные животные
356.7±5.8
1.701±0.031
2.298±0.062
Животные после криодеструкции
366.7±28.9
1.395±0.125 *
2.004±0.066 *
* - отличия достоверны, p<0.05
Как видно из таблицы 3, убыль относительной массы ЛЖ (на единицу массы тела) после криодеструкции составила примерно 13%, а для свободной стенки ЛЖ этот показатель составил 17%.
Площадь некроза после криодеструкции по отношению к общей площади свободной стенки ЛЖ составила со стороны эпикарда 25.1±3.6%, со стороны эндокарда - 23.0±4.2%. Площадь трансмурального некроза после криодеструкции по отношению к общей площади свободной стенки ЛЖ составила со стороны эпикарда 11.4±0.7%, со стороны эндокарда - 6.4±2.5%.
Таким образом, проведенная нами морфометрия макропрепаратов поврежденного сердца позволила установить достоверное снижение мышечной массы ЛЖ, что неизбежно должно было бы привести к снижению его сократительной активности.
Исследование насосной функции сердца в стендовых условиях подтвердило, что через 1 месяц после криодеструкции (II группа опытов, см. таблицу 1) действительно происходит снижение сократительных свойств ЛЖ по сравнению с интактными (1 группа), однако выявить эти различия нам удалось только при последовательном воздействии нагрузок на ЛЖ сначала объемом, а затем сопротивлением на выходе из ЛЖ в аорту (таблицы 4 и 5). Мы установили (таблица 4), что после криодеструкции (2 группа) АО был достоерно ниже при 2, 3 и 6 режимах, отношение АО/МО - при 3 и 7 режимах, УО - при 3 режиме, РД - при 8 режиме. Мы установили также (таблица 5), что при переходе с режима 1 на режим 2 во 2 группе происходило достоверное меньшее повышение АО, МО, АО/МО, УО, чем в остальных группах. При сравнении режима 1 и режима 3 происходило также достоверно меньшее увеличение АО, МО, АО/МО, УО, чем в 1, 3 и 4 группах и достоверно большее повышение ДД по сравнению с интактными сердцами (1 группа).
Оценка сократительных свойств ЛЖ в стендовых условиях по Neely выявила таким образом в сердцах после криодеструкции признаки скрытой СН. Полученные результаты убедили нас в том, что модель СН, созданная методом криодеструкции, является адекватной моделью для изучения эффектов ФКМЦ и ПМСК при трансплантации этих клеток в принекротическую зону.
В таблицах 4 и 5 представлены результаты исследования насосной функции сердца через 3 недели после трансплантации ФКМЦ (3 группа) и ПМСК (4 группа) в принекротическую зону миокарда ЛЖ (4 недели после криодеструкции).
Из представленных таблиц следует, что насосная функция сердец 3 и 4 групп при воздействии нагрузочных режимов проявляли более выраженную способность обеспечивать норму функции миокарда (1 группа) по сравнению с поврежденными сердцами без клеточной терапии (2 группа) приближаясь к значениям исследуемых показателей у интактных сердец.
Так, при увеличении преднагрузки абсолютные значения АО, МО и УО достоверно повышались в группах 1, 3 и 4 по сравнению с группой 2, причем, относительный прирост этих показателей был также более выраженным в указанных группах (таблица 5). При переходе к режиму 3 наиболее выраженное повышение АО, МО и УО было отмечено в группе 3 по сравнению с группами 1 и 4.
При увеличении постнагрузки происходило снижение АО, МО и УО во всех группах, причем, при переходе к режиму 6 мы наблюдали самые низкие значения АО, МО, и УО у сердец группы 2.
В режиме 7 (при снижении постнагрузки на ЛЖ) АО, МО и УО вновь возрастали во всех группах, но не достигали соответствующих значений режима 5 за исключением 4-й группы, в которой АО и УО восстанавливались и достоверно отличались от аналогичных показателей в группах 2 и 3.
Следует особо подчеркнуть, что практически во всех использованных режимах нагрузок на ЛЖ как абсолютные, так и относительные значения АО, МО и УО во 2-й группе были ниже по сравнению с группами 1,3,4. Мы нашли также, что во всех группах КО, являющийся составной частью МО, постепенно повышался в условиях последовательного применения нагрузок в режимах 1-6, однако более высоким повышение КО было в группе 3, особенно в режимах 4-6, когда доля АО в МО начинала постепенно снижаться. Систолическое давление (СД) в аорте во всех режимах было наименьшим в группе 3. В условиях высоких значений постнагрузки (режимы 4-7) наибольшие значения СД были отмечены в группе 4. В то же время, ЧСС в 3 группе была достоверно выше, чем в группах 1,2 и 4.


Таблица 4. Показатели функции изолированных сердец у животных разных групп при последовательном воздействии нагрузочных режимов.

Режим
АО. мл/(мин·г)
КО. мл/(мин·г)
МО. мл/(мин·г)
АО/МО. %
ЧСС. мин-1
УО. мл/г
Группа
1
1
111.0±32.4
51.8±9.1‡
162.9±35.7‡
67.0±7.6
282.2±23.6‡
0.4±0.12
2
243.7±76.2*
60.9±20.3‡
304.6±85.6‡
79.4±4.6
280.9±30.2‡
0.46±0.09
3
283.9±69.4*‡
61.4±20.6‡
345.3±81.3‡
82.1±3.8*
268.5±28.6‡
0.40±0.09*
4
258.2±64.0
80.4±31.5‡
338.5±83.4
76.4±5.4
273.3±27.7
0.40±0.08
5
210.8±59.3
92.2±43.2
303.0±84.9
70.0±7.4
276.1±25.3
0.86±0.24
6
101.7±25.2*
105.3±59.4
207.0±65.8
51.3±11.1
276.6±26.6
0.74±0.15
7
181.2±76.3
77.6±21.1‡
258.8±92.8
68.5±6.9*‡
274.9±28.1
0.93±0.13
8
?
?
?
?
?
?
Группа
2
1
127.4±20.9
50.9±5.1
178.3±20.6
71.1±4.5
278.3±28.9
0.89±0.16
2
203.7±42.9
58.7±6.4
262.4±43.9
77.0±5.1
272.3±26.4
1.07±0.28
3
232.3±43.9
72.4±32.5
304.8±57.1
76.6±7.4
263.6±28.7
0.83±0.17
4
211.7±63.6
81.1±15.2
292.8±72.4
70.9±9.1
262.3±30.6
1.18±0.19
5
161.0±70.0
94.9±30.0
255.8±84.4
64.7±6.9
264.3±31.0
1.04±0.21
6
76.9±30.4
108.6±48.2
185.5±64.7
45.1±9.4
265.2±35.1
0.96±0.27
7
128.4±65.4
99.5±41.2
227.9±87.8
58.4±9.3
265.2±38.4
0.80±0.24
8
?
?
?
?
?
?
Группа
3
1
124.2±31.0
71.1±12.7*
195.3±33.0
63.1±7.3*
307.8±22.2*
0.97±0.13
2
289.7±41.7*
81.5±21.5*
371.2±51.9*
78.1±4.0
312.8±17.4*
0.94±0.23*
3
357.7±44.7*
96.0±44.0
453.7±68.1*
79.4±6.7
300.9±12.4*
0.77±0.23*
4
292.2±48.1*
123.3±56.4*
415.6±83.4*
71.2±7.9
299.0±19.0*
0.67±0.21
5
208.4±32.6
133.5±57.3
341.9±71.3*
62.2±9.3
292.2±23.5*
0.72±0.09
6
95.7±13.9
159.0±90.5
254.7±87.8*
41.1±12.2
285.2±17.8
0.76±0.22
7
146.2±49.3
130.5±68.1
276.8±82.6
54.1±14.7
289.2±16.9
0.37±0.11
8
?
?
?
?
?
?
Группа
4
1
110.3±19.2
48.6±4.5‡
158.9±21.9‡
69.1±3.4
275.5±27.5‡
0.32±0.09
2
240.3±43.3*
53.8±7.1‡
294.1±48.8‡
81.5±2.0*
266.3±24.0‡
0.34±0.05
3
271.4±53.0‡
52.0±8.4‡
323.4±60.5‡
83.8±1.4*
258.8±25.5‡
0.36±0.10
4
252.5±61.0
71.3±9.9‡
323.8±68.9‡
77.5±3.5
269.0±28.5
0.67±0.28
5
203.0±60.8
81.6±11.6‡
284.6±68.1
70.2±6.8
267.4±26.2
0.54±0.23
6
98.4±24.9
97.2±17.2
195.5±35.2
49.9±7.1
269.6±25.2
0.51±0.17
7
208.9±64.7*
86.2±15.1
295.1±68.4
69.4±9.5*‡
271.3±27.6
0.76±0.23
8
?
?
?
?
?
?
* - достоверное отличие (р<0.05) от группы 2; ‡ - достоверное отличие (р<0.05) от группы 3. См. продолжение на след. странице.
Таблица 4. Показатели функции изолированных сердец у животных разных групп при последовательном воздействии нагрузочных режимов. (продолжение)

Режим
СД. мм.рт.ст.
ДД. мм.рт.ст.
РД. мм.рт.ст.
Время систолы. с
dP/dt. мм.рт.ст/с
Группа
1
1
88.3±21.2
47.2±15.4
41.0±13.2
0.065±0.017
644.8±180.4
2
106.9±25.0
39.7±17.2
67.2±16.7
0.069±0.018
987.1±260.7
3
104.5±22.6‡
35.3±16.5
69.2±16.2‡
0.069±0.019
1036.7±274.8
4
118.7±20.6
53.9±16.4
64.8±17.9
0.066±0.014
987.9±231.9
5
131.8±19.3
73.1±17.8
58.7±18.5
0.073±0.013
802.3±207.0
6
147.4±20.2
115.8±17.8
31.6±9.3
0.068±0.008
466.7±121.9
7
124.5±16.5
75.1±14.5
49.4±15.1‡
0.073±0.018
681.4±156.3
8
181.3±30.2‡
156.8±29.6‡
24.6±7.7*
?
?
Группа
2
1
82.2±24.5
39.9±13.5
42.3±17.3
0.076±0.022
545.4±123.9
2
103.4±22.3
35.8±12.2
67.5±21.7
0.077±0.025
895.9±209.3
3
98.6±18.5
36.0±13.2
62.5±16.3
0.073±0.019
870.0±207.4
4
113.2±20.9
55.9±16.4
57.3±19.0
0.070±0.012
818.5±252.2
5
125.6±22.6
75.1±17.0
50.5±20.6
0.076±0.012
667.3±280.6
6
133.5±27.7
108.3±21.9
25.3±11.9
0.070±0.008
357.7±159.3
7
124.1±22.7
79.7±19.4
44.4±14.8
0.072±0.014
627.3±214.7
8
151.8±32.2
136.2±28.3
15.5±7.9
?
?
Группа
3
1
76.3±17.5
44.3±13.2
32.1±11.1
0.056±0.015*
583.4±185.8
2
88.9±31.4
39.2±18.9
49.8±21.9*
0.055±0.009*
911.1±381.4
3
83.5±18.0
33.9±15.4
49.6±15.1
0.056±0.007*
913.7±330.6
4
102.2±19.6
52.8±16.1
49.4±15.5
0.059±0.005
848.0±294.4
5
116.3±20.9
74.0±15.1
42.3±14.1
0.063±0.008*
675.5±232.7
6
126.4±27.0
100.6±21.5
25.8±10.1
0.064±0.007
411.0±166.3
7
106.9±25.0
74.5±21.9
32.4±14.0
0.066±0.010
494.5±194.4
8
137.9±28.8
121.5±25.7
16.5±8.8
?
?
Группа
4
1
83.0±13.4
43.3±13.9
39.8±7.3
0.056±0.013*
734.3±174.0*
2
96.8±13.4
36.3±13.3
60.6±11.6
0.060±0.012*
1038.2±218.3
3
95.6±17.5
34.8±14.5
60.8±16.0
0.061±0.011
1016.1±250.9
4
119.9±15.3
53.0±14.0
66.9±17.1
0.065±0.014
1037.8±204.1
5
136.6±15.1
73.3±15.0
63.3±15.4‡
0.070±0.015
920.8±210.7*
6
157.5±17.1*‡
120.3±15.0
37.3±9.6*
0.067±0.010
551.5±110.1*
7
135.3±16.2‡
75.3±16.4
60.1±17.6*‡
0.067±0.009
897.1±221.6*‡
8
175.6±13.2‡
146.7±11.3
28.9±8.2*‡
?
?
* - достоверное отличие (р<0.05) от группы 2; ‡ - достоверное отличие (р<0.05) от группы 3.

Таблица 5. Относительные изменения показателей функции изолированных сердец у животных разных групп при последовательном воздействии нагрузочных режимов.

АО
КО
МО
AO/МО
ЧСС
УО
режим 2 / режим 1
Группа 1
2.26±0.37
1.18±0.136
1.88±0.22*
1.19±0.09*
0.99±0.07
2.29±0.42*
Группа 2
1.60±0.24
1.16±0.15
1.47±0.15
1.09±0.08
0.98±0.04
1.64±0.28
Группа 3
2.41±0.46*
1.14±0.14
1.92±0.21*
1.25±0.11*
1.02±0.06
2.38±0.52*
Группа 4
2.19±0.24*
1.11±0.12
1.85±0.18*
1.18±0.04*
0.97±0.08
2.28±0.32*
режим 3 / режим 1
Группа 1
2.55±0.71*
1.18±0.27
2.09±0.45*
1.21±0.12*
0.96±0.09
2.65±0.64*
Группа 2
1.72±0.29
1.48±0.74
1.66±0.35
1.05±0.1
0.95±0.1
1.81±0.28
Группа 3
3.03±0.62*
1.32±0.46
2.37±0.38*
1.28±0.12*
0.89±0.3
2.82±1.15*
Группа 4
2.50±0.57*
1.08±0.21
2.06±0.43*
1.21±0.05*
0.94±0.09
2.71±0.83*
режим 4 / режим 3
Группа 1
0.87±0.14
1.26±0.19
0.94±0.15
0.93±0.03
1.01±0.06
0.85±0.11
Группа 2
0.88±0.19
1.26±0.16
0.96±0.16
0.9±0.08
1.00±0.04
0.88±0.21
Группа 3
0.81±0.07
1.28±0.09
0.91±0.08
0.9±0.03
0.99±0.05
0.82±0.06
Группа 4
0.92±0.08
1.39±0.18
1.00±0.07
0.92±0.03
1.04±0.06
0.89±0.
режим 5 / режим 3
Группа 1
0.71±0.14
1.42±0.25
0.84±0.16
0.85±0.06
1.03±0.08
0.69±0.11
Группа 2
0.81±0.23
1.53±0.48
0.89±0.27
0.82±0.07
1.00±0.19
0.73±0.21
Группа 3
0.59±0.08
1.40±0.17
0.75±0.11
0.78±0.06
0.96±0.06
0.60±0.08
Группа 4
0.73±0.12
1.60±0.33
0.88±0.11
0.84±0.08
1.04±0.08
0.72±0.13
режим 6 / режим 4
Группа 1
0.40±0.07
1.27±0.25
0.61±0.09
0.66±0.12
1.01±0.04
0.40±0.07
Группа 2
0.38±0.09
1.30±0.38
0.63±0.13
0.61±0.11
1.01±0.1
0.38±0.09
Группа 3
0.33±0.07
1.26±0.23
0.61±0.13
0.57±0.12
0.96±0.04
0.35±0.06
Группа 4
0.40±0.08
1.36±0.13
0.62±0.1
0.64±0.08
1.00±0.06
0.39±0.07
режим 5 / режим 7
Группа 1
0.85±0.22
0.95±0.14
0.88±0.19
0.96±0.07
1.00±0.07
0.84±0.2
Группа 2
0.80±0.18
1.03±0.12
0.90±0.15
0.9±0.08
1.01±0.07
0.80±0.17
Группа 3
0.70±0.22
0.96±0.16
0.81±0.17
0.86±0.15
1.00±0.06
0.72±0.21
Группа 4
1.03±0.14
1.05±0.07
1.04±0.09
0.99±0.07
1.02±0.08
0.99±0.12
* - достоверное отличие (р<0.05) от группы 2. См. продолжение на след. странице.
Таблица 5. Относительные изменения показателей функции изолированных сердец у животных разных групп при последовательном воздействии нагрузочных режимов. (продолжение)

СД
ДД
РД.
Время систолы
dP/dt
режим 2 / режим 1
Группа 1
1.21±0.1
0.81±0.15
1.66±0.21
1.05±0.2
1.64±0.32
Группа 2
1.28±0.24
0.92±0.31
1.65±0.3
1.02±0.14
1.65±0.41
Группа 3
1.15±0.15
0.86±0.24
1.54±0.28
1.00±0.15
1.56±0.28
Группа 4
1.18±0.12
0.83±0.13
1.55±0.35
1.08±0.11
1.45±0.31
режим 3 / режим 1
Группа 1
1.21±0.13
0.74±0.21*
1.77±0.4
1.16±0.29
1.59±0.47
Группа 2
1.33±0.26
1.00±0.42
1.75±0.32
1.04±0.16
1.72±0.42
Группа 3
1.05±0.38*
0.69±0.31*
1.65±0.8
0.99±0.42
1.57±0.77
Группа 4
1.16±0.18
0.80±0.17
1.55±0.41
1.11±0.16
1.44±0.49
режим 4 / режим 3
Группа 1
1.18±0.06
1.98±1.25
0.96±0.11
1.03±0.14
0.95±0.17
Группа 2
1.22±0.09
1.69±0.56
1.01±0.27
1.05±0.1
0.97±0.29
Группа 3
1.23±0.15
1.77±0.54
0.98±0.23
1.07±0.08
0.93±0.21
Группа 4
1.27±0.12
1.61±0.27
1.11±0.15
1.07±0.16
1.06±0.22
режим 5 / режим 3
Группа 1
1.32±0.08
2.83±0.18
0.87±0.14
1.16±0.21
0.78±0.21
Группа 2
1.34±0.14
2.31±0.98
0.88±0.3
1.13±0.1
0.78±0.27
Группа 3
1.41±0.22
2.62±0.32
0.88±0.34
1.15±0.16
0.77±0.29
Группа 4
1.45±0.16
2.26±0.44
1.06±0.19
1.15±0.16
0.94±0.22
режим 6 / режим 4
Группа 1
1.25±0.11
2.27±0.52
0.49±0.08
1.05±0.16
0.48±0.12
Группа 2
1.18±0.14
2.03±0.45
0.43±0.15
1.02±0.2
0.43±0.15
Группа 3
1.25±0.09
1.95±0.5
0.54±0.1
1.08±0.08
0.50±0.07
Группа 4
1.32±0.12
2.36±0.44
0.56±0.08
1.05±0.15
0.53±0.05
режим 5 / режим 7
Группа 1
0.96±0.03
1.07±0.07
0.85±0.15
0.98±0.12
0.88±0.2
Группа 2
0.98±0.07
1.09±0.13
0.85±0.24
0.96±0.09
0.90±0.28
Группа 3
0.92±0.12
0.99±0.17
0.79±0.21
1.04±0.12
0.76±0.22
Группа 4
0.99±0.06
1.03±0.05
0.95±0.12
0.98±0.14
0.98±0.15
* - достоверное отличие (р<0.05) от группы 2.

Максимальные значения СД (СДмакс), диастолического давления (ДДмакс) и развиваемого максимально давления (РДмакс= СДмакс - ДДмакс) при пережатии выхода из аорты на 10 секунд (режим 8) были также наименьшими в группе 3, причем эти показатели достоверно не отличались от аналогичных показателей группы 2. Время систолы ЛЖ в 3 и 4 группах при повышении преднагрузки было достоверно снижено по сравнению со 2 группой. Между тем, скорость нарастания систолического давления в устье аорты (dP/dt), характеризующая состояние сократительного аппарата ЛЖ, была достоверно выше (в режимах 1,5,6) только в 4 группе по сравнению со 2 группой. В режиме 7 при резком снижении постнагрузки для сердец 4 группы dP/dt было достоверно выше не только по сравнению с сердцами группы 2, но и с сердцами 3 группы.
Таким образом, мы нашли, что трансплантация аллогенных ФКМЦ (3 группа) и аутологичных ПМСК КМ (4 группа) в миокард после криодеструкции улучшает показатели насосной функции поврежденного сердца. По сравнению со 2 группой в группах 3 и 4 наступал прирост относительного изменения АО, МО, УО и доли АО в МО при сравнении режимов 2-1 и 3-1, а также прирост РД при сравнении режимов 6-4 (таблица 5); кроме того, время систолы ЛЖ было при ряде нагрузочных режимов достоверно снижено (таблица 4). Примечательным, однако, явился тот факт, что в 4 группе также, как в 1 группе, при последовательном воздействии нагрузочных режимов значительное количество исследуемых показателей достоверно отличались от тех же показателей в 3 группе, где трансплантировали аллогенные ФКМЦ (таблица 4) и где использовался иммуносупрессант циклоспорин А. Так, в 4 группе по сравнению с 3 группой АО был достоверно ниже в 3 режиме, КО - ниже в режимах 1-5, МО - в режимах 1-4, ЧСС - в режимах 1-3; однако, доля АО в МО в 7 режиме, СД в режимах 6-8, РД в режимах 5,7,8 и dP/dt в 8 режиме были достоверно выше в 4 группе по сравнению с 3 группой.
Мы считаем также, что сравнительное исследование сократительных свойств миокарда позволило нам выявить не только сходство, но и различия в реакции сердец на нагрузочные тесты после трансплантации в них ФКМЦ и ПМСК КМ.
Мы нашли, что в этих группах сердца адекватно реагируют на преднагрузку и, следовательно, их функционирование подчиняется закону Франка-Старлинга. Между тем, было отмечено, что после трансплантации ФКМЦ сердца были более чувствительны к воздействию преднагрузок, чем после трансплантации МСК.
Исследование сократительных свойств сердец в условиях применения постнагрузок (режимы 4-7) показало, что сердца после трансплантации ПМСК КМ приблизительно вдвое более резистентны к действию возрастающих нагрузок, чем сердца с трансплантированными ФКМЦ. Мы полагаем, что сниженная устойчивость сердец с трансплантированными ФКМЦ может быть обусловлена цитотоксическим действием на миокард длительно применяемого после трансплантации циклоспорина А (Stovin PG, 1987).
Регистрируемые при трансплантации ФКМЦ (3 группа) более высокая доля КО в МО и более высокая ЧСС уже в режиме преднагрузок, а также достоверно более низкие значения СД, РД и dP/dt в режиме постнагрузок указывают, по нашему мнению, на развитие после трансплантации ФКМЦ циклоспориновой гистотоксической гипоксии миокарда, изменяющей его адаптационные возможности за счет снижения компенсаторных резервов.
При электронно-микроскопическом исследовании выявлено, что в группах 3 и 4 зона 1 (рубцовая зона) практически не отличалась от контроля (группа 2). В поле зрения имелись структуры, характерные для рубцовой ткани. Это соответствовало нашим данным по морфологии макропрепаратов.Миокард зоны 2 (околорубцовая зона) в группе 2 напоминал строение зоны 1 в группах с криодеструкцией: имелось большое количество КМЦ с необратимыми ишемическими повреждениями (фрагментация КМЦ, митохондрии с гомогенизированным матриксом). В группе 3 в зоне 2 мы нашли отдельные фрагментированные КМЦ с нечеткой боковой сарколеммой, выраженными нарушениями в митохондриях (вакуолизация, гомогенизация матрикса), расширенными Z-полосками, что свидетельствует о необратимом ишемическом повреждении. В группе 4 в зоне 2 встречаются КМЦ как с обратимыми повреждениями (отдельные митохондрии с гомогенизацией матрикса, и редукцией крист, незначительное расширение структур саркоплазматического ретикулума), так и с необратимыми (фрагментация отдельных КМЦ).
В 1 группе в зоне 3 (дистальной околорубцовой) миокард характеризован нами как функциональный. Имеются небольшие ультраструктурные изменения (частичная редукция крист), возможно, связанные с длительной перфузией изолированных сердец. В группе 2 в зоне 3 имеются признаки выраженного ишемического повреждения отдельных КМЦ: нечеткие и разреженные сократительные структуры с малым количеством миозиновых и актиновых волокон в саркомерах, большинство митохондрий с частичной или полной редукцией крист, выраженная вакуолизация структур саркоплазматического ретикулума. В 3 группе в зоне 3 миокард практически нормальной структуры, имеется лишь незначительная гомогенизация матрикса в отдельных митохондриях. В 4 группе в зоне 3 миокард охарактеризован нами как функциональный с незначительными ишемическими повреждениями (пересокращение отдельных саркомеров, отдельные митохондрии с незначительной редукцией крист).
Эти данные свидетельствует о более широкой зоне периинфарктного поражения в группе 2 по сравнению с группами 3 и 4.
С помощью гистохимических методик (окраска на ?-галактозидазу) было установлено, что по крайней мере через 3 недели после трансплантации сохраняется присутствие ФКМЦ и ПМСК в принекротической зоне. Эти данные позволяют нам связать все выше описанные эффекты клеточной терапии с присутствием в сердечной мышце жизнеспособных ФКМЦ и ПМСК.
Выводы
1. Культуры аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных клеток костного мозга со свойствами кардиомиоцитоподобных клеток (способны спонтанно и ритмично сокращаться, имеют положительную окраску на кардиоспецифический белок тропонин I, электронно-микроскопически идентифицируются как клетки миобластоидного ряда) пригодны для восполнения дефицита клеток, участвующих в регуляции восстановительных процессов в миокарде.
2. Фетальные кардиомиоциты и предифференцированные мезенхимальные клетки костного мозга позволяют ослабить признаки скрытой левожелудочковой недостаточности в криоповрежденных сердцах уже через 3 недели после их трансплантации в принекротическую зону.
3. Фетальные кардиомиоциты и предифференцированные мезенхимальные клетки костного мозга, трансплантированные в криоповрежденный миокард, повышают систолическую функцию левого желудочка в режиме последовательного повышения преднагрузок. Трансплантация аутологичных предифференцированных мезенхимальных клеток костного мозга кроме того повышает устойчивость миокарда к воздействию постнагрузок.
4. Восстановление показателей насосной функции сердца после проведения клеточной трансплантации связано с повышением регенераторной способности миокарда и уменьшением зоны деструкции вокруг очага некроза.
5. Изменение морфо-функционального состояния поврежденного сердца связано с присутствием в миокард жизнеспособных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных клеток костного мозга (по окраске на ?-галактозидазу).
6. Повреждение миокарда методом криодеструкции является адекватной моделью для изучения терапевтических эффектов фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных клеток костного мозга при трансплантации в принекротическую зону.
7. Исследования насосной функции поврежденных сердец в условиях применения дозированных пред- и постнагрузок на ЛЖ позволяют объективно оценивать терапевтические эффекты трансплантации в миокард ФКМЦ и ПМСК КМ.
Практические рекомендации
1. В связи с существующими этическими и правовыми ограничениями использования аллогенных фетальных кардиомиоцитов в клинике, а также с необходимостью длительного использования у реципиента этих клеток иммуносупрессивных препаратов при выборе клеточного материала для трансплантации кардиологическим больным предпочтение следует отдавать аутологичным предифференцированным мезенхимальным клеткам костного мозга.
2. Поскольку костный мозг содержит наибольшее количество мезенхимальных стволовых клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и способностью дифференцироваться в кардиомиоцитарном направлении, то аутологичный костный мозг следует использовать для получения мезенхимальных стволовых клеток, последующего их культивирования и наращивания клеточного материала в количествах, достаточных для трансплантации.
3. Для усиления предифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиогенном направлении следует применять среды, в состав которых входит FGFb, а также временно использовать деметилирующий ДНК агент 5-азацитидин. Выращенные в таких условиях культуры клеток могут быть рекомендованы для клинического применения путем трансплантации в миокард больным ИБС, кардиомиопатиями.
4. Для получения максимального эффекта от метода клеточной трансплантации при инфаркте миокарда пересаживаемый клеточный материал должен непосредственно находиться в микроокружении собственных кардиомиоцитов хозяина, поэтому клетки следует трансплантировать в периинфарктную зону, где повреждения сократительного аппарата носят обратимый характер.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Потапов ИВ, Онищенко НА, Крашенинников МЕ. Клеточная кардиомиопластика (аналитический обзор). - Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2001. - №3. - с..
2. Хубутия АШ, Берсенев АВ, Потапов ИВ и др. Экспериментальные модели повреждения миокарда и печени для изучения биологических и клинических эффектов метода клеточной трансплантации. - В материалах тезисов конференции "Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты), Москва, 27-28 июня 2002 г. - с. 226-227.
3. Шумаков ВИ, Онищенко НА, Крашенинников МЕ, Зайденов ВА, Потапов ИВ и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов. - Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2002. - №4. - с. 46-53.
4. Потапов ИВ, Башкина ЛВ, Зайденов ВА, Аврамов ПВ. Влияние пересадки эмбриональных кардиомиоцитов и мезехимальных стволовых клеток костного мозга на сократительную функцию сердца при экспериментальном инфаркте миокарда. - В материалах тезисов II Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, Москва, 17-19 октября 2002 г. Вестник траснплантологии и искусственных органов, №3, 2002 г. с.88-89.
5. Крашенинников МЕ, Зайденов ВА, Потапов ИВ и др. Выявление кардиоспецифического тропонина I в предифференцированных мезенхимальных стволовых клетках костного мозга млекопитающих. - В материалах тезисов II Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, Москва, 17-19 октября 2002 г. Вестник траснплантологии и искусственных органов, №3, 2002 г. с. 87.
6. Шумаков ВИ, Онищенко НА, Крашенинников МЕ, Зайденов ВА, Потапов ИВ и др. Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито-подобные клетки у различных видов млекопитающих. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001 г. - №4. - с. 461-465.
7. Потапов ИВ, Башкина ЛВ, Онищенко НА и др. Характеристика насосной функции сердца после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и мезехимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. - Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2003 г. №3 с. 38.
8. Onischenko NA, Krasheninnikov ME, Rasulov MF, Potapov IV et al. Experimental models and technological approach for the estimation of therapeutic efficiency of organ dysfunction, by bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Int J Artif Organs 2003; 26; 7:563 (abstract 127).
Список сокращений.
ИМ - инфаркт миокарда; КД - криодеструкция; КМ - костный мозг; КМЦ - кардиомиоциты; ЛЖ - левый желудочек; М - миокард; МСК - мезенхимальные стволовые клетки; ПМСК - предифференцированные мезенхимальные стволовые клетки; СН - сердечная недостаточность; ТП - трансплантация; ФКМЦ - фетальные кардиомиоциты; FGFb - фактор роста фибробластов b.
1 Животные, использованные для морфометрического исследования
2 Летальность после КД составила 6%, после ТП ФКМЦ - 26%, после ТП ПМСК КМ - 15%, остальные животные не вошли в статистическую обработку в связи с техническими погрешностями при выполнении нагрузочных тестов на установке Neely.
??

??

??

??

30


2











СОДЕРЖАНИЕ