стр. 1
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

На правах рукописи




РЫЖКОВА ЕВГЕНИЯ ПЕТРОВНА




КОБАЛЬТ И КОРРИНОИДЫ В БИОЛОГИИ
PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII




03.00.07 – Микробиология




АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук




Москва - 2003
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета
Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова


Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов

Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор В.Д. Самуилов
доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова
доктор биологических наук Г.Л. Шапошников


Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие
«Государственный научно-исследовательский институт
генетики и селекции промышленных микроорганизмов»
(ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИ Генетика»)


Защита диссертации состоится 18 декабря 2003 г. в 1530 на заседании
Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном
университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские
горы, д.1, МГУ, корп.12, биологический факультет, аудитория М1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического
факультета МГУ им. Ломоносова.



Автореферат разослан «___» ____________ 2003 г.



Ученый секретарь
Диссертационного совета,
кандидат биологических наук Н.Ф. Пискункова
На правах рукописи




Eugenia P. RYZHKOVA (JORDAN)

Doctor of Science
(Microbiology-03.00.07)

Моscow - 2003

Department of Microbiology, Lomonosov Moscow State University, 119992, Moscow, Russia,
jane-r-iord@mail.ru




Cobalt and Corrinoids in Biology of
PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Физиология прокариот – центральное направление
микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности
организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых
микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи –
улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют
разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii (далее – P. freudenreichii) –
основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых»
сыров, а в России – и в производстве витамина В12, однако области применения ПКБ
этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным
«прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный
тематический симпозиум “Propionibacteria”. Научный интерес вызывает
неоднозначность метаболизма ПКБ, например их отношение к молекулярному
кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокислого
брожения, ПБ) и способности развиваться при доступе кислорода, – это
аэротолерантные анаэробы (Определитель бактерий Берджи, девятое издание, 1997),
но их относят к микроаэрофильным организмам (Воробьёва, 1958; 1976; Pritchard et
al., 1977; Ye et al., 1999). Актуальным является вопрос, каким образом ПКБ
обеспечивают свою аэротолерантность; и в этом направлении ранее была проделана
большая исследовательская работа, однако многое оставалось не выясненным.
Cуществует проблема метаболического лимитирования экспрессии генов в
норме (Головлёв, Головлёва, 2000); одновременно расширяется представление о
роли альтернативных ферментов в пластичности метаболизма бактерий (Якунин и
др., 1999). Выявление естественной модификации (перестройки) метаболизма
прокариот под действием факторов внешней (и внутренней) среды наряду с
изучением метаболического лимитирования биохимических реакций актуально в
связи с активным развитием метаболической инженерии. Главной задачей этого
нового направления биотехнологии является «оптимизация экспрессии генов» с
использованием целенаправленной переориентации потоков вещества (энергии) так,
что, активно продуцируя целевой метаболит, бактериальная клетка сохраняет свою
2
жизнеспособность. Этот подход принципиально отличен от «максимизации
экспрессии целевых генов» в клетках, погибающих в результате сверхпродукции
метаболита или чужеродного белка, в которых заинтересован только человек
[Дебабов, 1999; Машко и др., 2002].
В последнее десятилетие значительно возросло знание функций корриноидов
(соединений группы витамина В12) в биологии прокариот. Являясь древними
полифункциональными (био)катализаторами они вовлечены в центральные
метаболические процессы современных прокариот, такие как ПБ, метаногенез,
гомоацетогенез, сульфатредукция, биосинтез метионина и дезоксирибозильных
предшественников ДНК и другие. К настоящему времени открыто и изучено более
тридцати биохимических реакций, катализируемых корриноидсодержащими
ферментами. Открытие новых функций корриноидов продолжается [Рыжкова
(Иордан), 2003]. Проблемам биосинтеза и функций корриноидов посвящают
международные конференции (последняя происходила в 1996 году в Австрии), но,
несмотря на обнаружение всё новых биохимических реакций, протекающих при
участии корриноидов, актуален вопрос о физиологическом значении его высокого
естественного уровня образования в клетках некоторых бактерий и архей. Новый
взгляд на роль кобальта и корриноидов в жизнедеятельности P. freudenreichii
неизбежно ускорил бы изучение этого явления у других прокариотических
организмов.
Состояние вопроса. В исследованиях В.Я. Быховского значительное внимание
было уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина В12) в биосинтезе
корриноидов – соединений группы витамина В12 (Быховский и др., 1969 а,б; 1975;
Быховский, 1979; Быховский, Зайцева, 1989; Bykhovsky еt al., 1997). Значение ионов
кобальта и корриноидов для жизнедеятельности бактерии в целом оставалось вне
поля зрения авторов. Вместе с тем потребность в ионах кобальта для роста культур
(и образования корриноидов) в своё время отмечали у представителей р. Rhizobium
(Kliewer, Evans, 1963; Cowles et al., 1969) и некоторых цианобактерий (Fogg et al.,
1973; Beck, 1982).
Известно, что среди неполимерных соединений корриноиды – сложнейшие
молекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление
которой определяет их множественные химические и биохимические функции
3
(Рыжкова, 2003). Биосинтез корриноидов требует значительных затрат
центроболитов и энергии, однако некоторые бактерии и археи способны к
естественному образованию и внутриклеточной аккумуляции корриноидов в
количествах, в 100 – 1000 раз превышающих обычные уровни их содержания в
клетках (единицы – десятки мкг на грамм АСБ). Вопрос о биологическом значении
этого явления был впервые поставлен в отношении P. freudenreichii (Barker et al.,
1958; Weisbach et al., 1959). Открывали всё новые биохимические (коферментные)
функции корриноидов, изучали механизмы их действия, но на главный вопрос
ответа не было.
Неоднозначность метаболизма пропионовокислых бактерий, возможность его
перестроек, констатирована при изучении влияния молекулярного кислорода на
энергетический обмен ПКБ, в котором помимо основного процесса – ПБ,
включающего в себя электрон-транспортную цепь с использованием фумарата в
качестве конечного акцептора электронов, определённое место занимает дыхание
кислородное. Фактором перестройки энергетического обмена ПКБ, в том числе и P.
freudenreichii, служит молекулярный кислород. При ограниченной аэрации у P.
freudenreichii функционирует дыхательная цепь, которая имеет, прежде всего,
предохранительное (от токсического действия кислорода) значение (De Vries et al.,
1972; Бонарцева, 1973; Брюхачева и др., 1975; Pritchard, 1977; Pritchard, Asmundson,
1980; Скулачёв, 1997; Edwards et al., 2000). Обнаружение ферментов
антиокислительной защиты клеток (ФАОЗ): супероксиддисмутазы (СОД), каталазы
и пероксидазы – позволило подойти к объяснению аэротолерантности P.
freudenreichii (Воробьёва, 1976; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986),
однако вопрос о причинах устойчивости бактерии к действию молекулярного
кислорода не был исчерпан.
ПКБ обладают эффективным и пластичным конструктивным обменом. Они
синтезируют все необходимые аминокислоты и другие компоненты клетки,
развиваясь на минеральных средах с одним из многих сахаров (или иным
источником органического углерода) и некоторыми витаминами (ауксотрофы по
пантотеновой кислоте и биотину). Вместе с тем ПКБ используют для роста аминный
или молекулярный азот (Баранова, Климонтович, 1971; Баранова, Гоготов, 1974).
4
В поле зрения всегда оставалась удивительная способность P. freudenreichii
подвидов shermanii и freudenreichii к накоплению в клетках больших количеств
корриноидов (соединений группы витамина В12, кобамидов, Cba), среди которых
доля кобаламина (Cbl) – истинного витамина В12, в молекулу которого входит
азотистое основание 5,6-диметилбензимидазол (Krautler, 1998 a), составляет ˜ 10%
(Быховский, Зайцева, 1989; Bykhovsky еt al., 1997).
Существовало представление о «настройке» метаболизма P. freudenreichii
исключительно на высокий уровень их образования как физиологической
особенности бактерии (Воробьёва, 1995; Vorobjeva, 1999, 2000). Высказывалось
также противоположное мнение о дерегуляции биосинтеза этих соединений, однако
для его отрицания появлялись всё новые наблюдения, например постоянство
содержания Cbl в клетках экспоненциально растущей культуры (Воробьёва, 1976),
регулируемость биосинтеза корриноидов (Быховский, 1979; Bykhovsky et al., 1997).
К началу наших исследований в метаболизме P. freudenreichii были известны две
биохимические реакции, катализируемые кобамид-зависимыми ферментами:
ключевая реакция ПБ (изомеризация сукцинил-КоА в метилмалонил-КоА) и
биосинтез метионина. Ферменты этих реакций используют кобамиды в качестве
коферментов, но проявляют разную специфичность к форме кобамида (Overath et
al., 1962; Skupin et al., 1970; McKie et al., 1990; Chowdhury et al., 2001).
Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы была определена
как поиск и раскрытие биологического смысла способности Propionibacterium
freudenreichii subsp. shermanii к образованию внутриклеточных корриноидов в
высоких концентрациях в период активного развития, что свойственно и некоторым
другим прокариотам. Поэтому в целом работа была направлена на изучение роли
кобальта и корриноидов в жизнедеятельности бактерии. Принципиальный
методологический подход состоял в выявлении различий в физиологическом
состоянии бактерии: её развитии, выживании и метаболическом статусе – при
нормальном (физиологическом) уровне образования корриноидов и при снижении
последнего, вплоть до глубокого (1000-кратного) дефицита в клетках.
Основные задачи, на решение которых была направлена работа, заключались в
следующем:
1. Исследовать последствия изменения концентрации соли кобальта в среде для
5
развития P. freudenreichii в разных условиях культивирования в связи с
изменяющимся уровнем эндогенных корриноидов – соединений группы витамина
В12 (кобамидов). Установить физиологически значимый или нормальный
(соответствующий наиболее активному развитию бактерии) уровень их
образования в клетках.
2. Оценить возможность развития бактерии при свободном доступе воздуха
(аэротолерантность) в сравнении с аноксическими условиями на разных средах, а
также устойчивость клеток к летальному действию УФ-излучения в норме и при
лимитировании клеток по содержанию корриноидов.
3. Определить уровни эндогенных кобамидов, необходимые для эффективного
пропионовокислого брожения, биосинтеза метионина и образования нуклеиновых
кислот в клетках бактерии.
4. Проанализировать воздействие разных форм корриноидов на образование
ДНК в клетках дефицитной по ним бактерии. Доказать прямое специфическое
вовлечение кобаламина (истинного витамина В12) в процесс и показать его
метаболическое лимитирование кобаламином в полноценных по содержанию
суммарных корриноидов клетках.
5. Объяснить участие кобаламина в анаболизме ДНК, с одной стороны, и не
прекращающийся биосинтез ДНК при глубоком дефиците корриноидов в клетках, с
другой.
6. Исследовать функциональные и некоторые структурные свойства
альтернативных (в отношении зависимости от аденозилкобаламина)
рибонуклеотидредуктаз (РНРаз, КФ 1.17.4.-), ответственных за формирование пула
дезоксирибозильных предшественников ДНК.
7. На примере системы РНРазы выявить регуляторное действие кобаламина;
показать его функцию как фактора физиологической (метаболической) перестройки
бактерии.
Научная новизна и значимость работы. В результате обобщения
полученных в настоящей работе экспериментальных данных и имеющихся научных
предпосылок возникло новое представление о двойственном характере физиологии
Propionibacterium freudenreichii, определяемом ионами кобальта в среде и уровнем
образования корриноидов в клетках.
6
Бактерия представляет собой пример прокариота, у которого кобальт не только
контролирует (и стимулирует) образование корриноидов, но в определённых
условиях служит фактором роста. Концентрационную зависимость роста
прокариотического организма от соли кобальта в среде проследили впервые
(Иордан и др., 1984); позже она была исследована у Methanosarcina barkeri (Kumar
et al., 1987). Нам представляется, что это должно быть учтено в отношении других
микроорганизмов, обладающих способностью к образованию корриноидов в
значительных количествах.
Установили, что естественный высокий уровень образования корриноидов, на 2
– 3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов по витамину В12,
существен для аэротолерантности и УФ-резистентности бактерии, что, видимо,
отражает особенность предков ПКБ, их первичную среду обитания и экологическую
нишу в условиях древней Земли. Впервые корриноиды рассматриваются как
возможные (дополнительные) факторы защиты прокариотической клетки от
стрессорного (токсического) действия кислорода.
Выяснили, что для нормальной интесивности ПБ P. freudenreichii достаточно ˜
1% синтезируемых ею кобамидов, что объясняется широкой специфичностью
ключевого фермента ПБ к разнообразным формам кобамидов. Cbl-зависимая
реакция биосинтеза метионина сохраняет свою эффективность при снижении
общего содержания кобамидов на порядок. Вместе с тем, биосинтез ДНК в клетках
P. freudenreichii метаболически лимитирован по Cbl даже при высоком уровне
образования корриноидов. Стимулирующий эффект Cbl в отношении биосинтеза
ДНК показан нами для представителей других видов ПКБ и некоторых
стрептомицетов. Пришли заключению, что с уровнем Сbl может быть связано
непостоянство содержания ДНК в прокариотической клетке. Установленное нами
прямое и специфическое воздействие Cbl на образование ДНК позволяет
прогнозировать его участие в физиологическом контроле репликации (и
генетических процессов, которые репликацию включают) у многих прокариот,
синтезирующих или требующих витамин В12 (условие необходимое).
Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о
вовлечении метилкобаламина (MeCbl) в качестве донора метильных групп в
трансметилирование ДНК альтернативно по отношению к S-аденозилметионину.
7
Это третья биохимическая реакция в метаболизме P. freudenreichii, протекающая
при участии витамина В12. Обнаруженное нами зависимое от аденозилкобаламина
(AdoCbl) превращение рибонуклеотида в дезоксирибонуклеотид явилось четвёртой
реакцией, известной в настоящее время в метаболизме P. freudenreichii, в которой
участвует кобамид.
Для P. freudenreichii впервые показано, что РНРаза, катализируя первую
специфическую и скоростьлимитирующую реакцию анаболизма ДНК, облигатно
требует аденозилированный кобаламин (AdoCbl), при этом естественный уровень
кобамидов (кобаламина) в клетках бактерии в норме ограничивает её активность.
Обнаружение этого фермента позволило объяснить прямую и специфическую
зависимость образования ДНК от кобаламина у бактерии и дало возможность
преодолевать метаболическое лимитирование процесса по нему. Функционирование
AdoCbl-РНРазы в клетках – условие достаточное для того, чтобы стимулировать
биосинтез ДНК у того или иного прокариота витамином В12 (AdoCbl).
Впервые обнаружили, что P. freudenreichii, в отличие, например, от Rhizobium
meliloti (Cowles et al., 1969), способна активно развиваться на «бескобальтовой»
среде, практически не синтезируя корриноиды. При этом она испытывает
потребность в дополнительных факторах роста, например цистеине, метионине,
восстановленном глутатионе или триптоне, и перестраивает метаболизм. При
глубоком дефиците корриноидов в клетках изменяется характер ПБ; образование
ДНК происходит без участия кобаламина, причём AdoCbl в этом случае подавляет
процесс. Установили, что основной «мишенью» служит дублирующая РНРаза,
зависимая от ионов марганца и активируемая молекулярным кислородом,
активность которой AdoCbl ингибирует. Альтернативные РНРазы в клетках одного
организма показаны впервые (Иордан и др., 1975; 1986; 2000; Иордан и др., 1986;
Иордан, Петухова, 1989; Иордан, 1992). Полученные нами результаты были
подтверждены на примерах других бактерий (Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989;
Jordan et al., 1999; Borovok et al., 2002).
Мы также впервые наблюдали обратимую перестройку метаболизма P.
freudenreichii под действием ионов кобальта или кобаламина. Ионы кобальта,
добавленные в среду, на которой активно развивается испытывающая глубокий
дефицит корриноидов (кобаламина) бактерия, возвращают ей первоначальное
8
физиологическое состояние: возобновляется биосинтеза корриноидов и способность
бактерии развиваться на минимальной среде в присутствии воздуха. Экзогенный
кобаламин (AdoCbl) вызывает перестройку в системе альтернативных РНРаз
бактерии, действуя на уровне активности ферментов и биосинтеза белка.
Способность P. freudenreichii к альтернативным физиологическим состояниям в
зависимости от обеспеченности клеток кобальтом и корриноидами (кобаламином),
является проявлением её метаболической пластичности, обусловленной этими
факторами, что, видимо, способствует освоению бактерией новых сред обитания.
Практическая ценность. Некоторые установленные в настоящей работе
закономерности биологии P. freudenreichii нашли практическое применение. В
зависимости от конкретной задачи рекомендовано либо поддерживать высокий
уровень образования корриноидов в клетках бактерии, либо значительно снижать
его.
1) Для получения пропионовой кислоты, используемой в качестве антисептика в
пищевой промышленности и сельском хозяйстве, на основе иммобилизованных
клеток P. freudenreichii, синтезирующей витамин В12, создан биокатализатор и
предложен способ его реактивации (Воробьёва и др., 1978; Иордан и др., 1979).
2) Изобретения способов приготовления теста и защиты хлеба от «картофельной
болезни» при использовании в заквасках P. freudenreichii (с заданным уровнем
витамина В12 в клетках) внедрены в хлебопекарной промышленности (Богатырёва и
др., 1988; 1990).
3) На основе пермеабилизованных клеток P. freudenreichii, трансформирующих
рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды благодаря активности AdoCbl-РНРазы,
разработан способ получения дезоксирибонуклеотидов (Иордан, Прянишникова,
1997).
4) В связи с началом работ по генетической модификации штаммов бактерии,
применяемых в производстве «твёрдых» сыров типа «Швейцарский», практически
значимыми явились рекомендации по культивированию бактерии в условиях
активного биосинтеза ДНК, зависимого от обеспеченности клеток кобаламином
[Ryzhkova (Iordan), 2001].
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на
республиканских конференциях молодых учёных (Ташкент, 1976, 1978; Рига, 1977);
9
заседаниях секции и Съезде ВМО (Москва, 1980, 1982; Алма-Ата, 1985);
всесоюзных конференциях: «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Кобулети,
1986), «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов» (Пущино, 1989);
международных конференциях, симпозиумах и конгрессах: FEMS International
Symposium "Environmental regulation of microbial metabolism" (Puschino, USSR,
1983); 14th International Congress of Microbiology (Manchester, England, 1986); First
International Congress on Vitamins and Biofactors in Life Scince (Kobe, Japan, 1989); 4th
International Conference "Thioredoxins and related proteins" (Whitzenhausen – Kassel,
Germany, 1995); 5th International Conference "Thioredoxins and related proteins"
(Smolenice – Bratislava, Slovak Republic, 2000); 3rd International Symposium on
Propionibacteria (Zurich, Switzerland, 2001).
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, девяти глав
(обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение
экспериментов с обсуждением и заключениями, общее заключение), основных
выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 266 страницах,
содержит 19 таблиц и 48 рисунков. Список цитируемой литературы включает 385
работ.
Публикации. Опубликована 51 работа: статей 33, изобретений (авторских
свидетельств и патентов) 4, тезисов и докладов на конференциях и симпозиумах 14.
Место проведения работы. В основном работа проведена на кафедре
микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова при участии студентов, аспирантов и
сотрудников кафедры. Ряд совместных работ выполнены: в Отделе функциональной
биохимии биополимеров и в Отделе хроматографического анализа Института
физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ им. М.В. Ломоносова);
на кафедре микробиологии Братиславского университета (Словакия); в Лаборатории
основ действия радиации и биологически активных веществ на клетку Института
химической физики им. Н.Н. Семёнова (РАН), а также – в ГНИИ Хлебопекарной
промышленности (РАСХН).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Высокий естественный уровень образования корриноидов, реализуемый в
первичном обмене P. freudenreichii при достаточной концентрации ионов кобальта в
10
среде, имеет положительное (физиологическое) значение для бактерии в «жестких»
условиях существования, при воздействии стрессорных факторов среды.
2. Пропионовокислое брожение – основной энергетический процесс бактерии, не
снижает интенсивности при значительном уменьшении содержания витамина В12, но
для эффективного биосинтеза ДНК требуется высокий уровень образования
корриноидов в клетках бактерии. В анаболизм ДНК прямо и специфически вовлечён
кобаламин, который в норме лимитирует процесс на уровне образования
предшественников.
3. Бактерия, синтезируя на 2–3 порядка меньше корриноидов, чем в норме,
способна развиваться; при этом она испытывает новые ростовые потребности и
изменяет метаболизм.
4. Cинтез ДНК при дефиците корриноидов в клетках бактерии не прекращается и
происходит благодаря функционированию альтернативных ферментных систем
формирования предшественников ДНК, среди которых ключевой является
рибонуклеотидредуктаза, независимая от кобаламина.
5. Кобаламин участвует в перестройке системы альтернативных
рибонуклеотидредуктаз у P. freudenreichii.
10

.




.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Объекты и методы исследований
P. freudenreichii subsp. shermanii (ВКМ-103) – главный объект исследований. В
сравнительном плане были использованы штаммы ПКБ видов: P. freudenreichii
subsp. freudenreichii, P. globosum, P. thoenii, P. acidipropionici, P. jensenii, P. acnes и
P. coccoides (Воробьёва, 1976; Воробьёва и др., 1983), а также некоторые
срептомицеты и Escherichia coli 113-3. P. coccoides в настоящее время относят к р.
Luteococcus (Riedel, 1995; Riedel et al., 1998).
Культивирование P. freudenreichii и других ПКБ в экспериментах проводили
периодическим способом на жидких синтетических средах нескольких вариантов
при свободном доступе воздуха или в аноксических условиях.
С целью изменения уровня образования суммарных корриноидов (кобамидов) в
клетках ПКБ варьировали концентрацию соли кобальта (CoCl2.6H2O) в среде
(Быховский и др., 1969а; Bykhovsky et al., 1997).
Визуальное наблюдение строения бактериальных клеток проводили с
использованием техники электронной (сканирующей и трансмиссионной)
микроскопии (микроскопы JSM-35, “Jeol” и “Hitachi-11”, Япония). Размеры клеток
11

оценивали с помощью автоматической (компьютерной) системы анализа
изображений KS 300 (Germany).
Для измерения содержания корриноидов в клетках и идентификации их форм
применяли микробиологический, химический (спектрофотометрический) и
биоавтографический методы (Канопкайте, 1978; Егоров, 1986).
Интенсивность и характер ПБ исследовали путём анализа основных
выделяемых бактерией продуктов: пропионовой и уксусной кислот, в том числе с
применением метода газожидкостной хроматографии (Иордан и др., 1979).
Для измерения содержания нуклеиновых кислот (НК) в клетках после их
экстракции хлорной кислотой использовали традиционные
спектрофотометрические и колориметрические методы, среди них – метод Дише
(содержание ДНК) в модификации (Hatcher, Goldstein, 1969). Образование НК в
клетках оценивали по включению меченого (радиоактивного) нуклеинового
основания. Образование ДНК регистрировали по приобретённой радиоактивности в
результате инкубирования суспензии клеток (или культуры). Контролем служило
показание радиоактивности ДНК в присутствии митамицина С или блеомицина А5.
Радиоактивность НК (после разделения ДНК и РНК) измеряли на автоматическом
счётчике фирмы “Pharmacia-LKB”, Швеция. Интенсивность образования ДНК и
РНК рассчитывали как приобретённую радиоактивность ДНК (РНК): имп.мин-1 на 1
мг АСБ (1 мл суспензии клеток или 1мл культуры) за единицу времени
инкубирования.
При исследовании метаболических процессов и биохимических реакций
физиологических вариантов P. freudenreichii клетки подвергали разрушению и
экстракции их водорастворимых компонентов в буферные растворы. Разрушение
клеток проводили с помощью пресса Хьюза или ультразвукового дезинтегратора
(УЗДН-1, Россия). Для получения гомогенатов (экстрарактов) клеток, свободных от
клеточных фрагментов, использовали центрифугирование (центрифуга фирмы
“Beckman”, США, модель J2-21); для фракционирования гомогенатов, например при
изучении локализации ферментов в клетках, применяли ультрацентрифугирование
(центрифуга фирмы “Beckman”, модель L5-65B).
Измерение уровня сульфгидрильных групп в белках проводили методом
спектрофотометрического титрования диализованных экстрактов клеток, в том
числе с денатурированными 8М мочевиной белками, щелочным раствором ПХМБ в
кварцевых кюветах (Торчинский, 1971).
Определение активности РНРазы проводили путём инкубирования
диализованных гомогенатов клеток или препаратов выделенных белков в
реакционных смесях, содержащих субстрат (АДФ, ГДФ), восстановитель
(дитиотреитол, дигидролипоат-Na или НАДФН) и другие компоненты. Об
активности фермента судили по скорости образования продукта реакции –
дезоксирибонуклеотида, концентрацию которого измеряли флуориметрическим или
колориметрическим методами (Torley, Knutsen, 1976; Blakley, 1982), последний – в
собственно й модификации; радиохроматографически (Koller et al., 1980) в системе
обратнофазовой ВЭЖХ (HPLC, «Beckman», США) в собственной модификациии; а
также – по интенсивности специфического ЭПР сигнала (Пулатова и др., 1986),
вызванного AdoCbl-зависимым катализом, на радиоспектрометре ER 220D фирмы
“Bruker”, Германия. Контролями реакции, катализируемой РНРазой (всеми
способами определения активности фермента), являлись показания в точке «0-
времени»: полная реакционная смесь, инактивированная до начала инкубирования
12

(100оС, 3 мин) и показания после инкубирования реакционной смеси, не
содержащей субстрат. Контрольные показания вычитали из опытных.
Влияние О2 на активность РНРазы исследовали путём сравнения активности
фермента при инкубировании диализованных гомогенатов клеток в атмосфере
воздуха или инертного газа (в герметичных флаконах). Поглощение О2 измеряли с
помощью полярографа с закрытым электродом (тип Кларка).
Выделение и очистку рибонуклеотидредуктаз проводили из диализованных
экстрактов клеток после удаления из них (осаждением стрептомицин-сульфатом)
нуклеиновых кислот (Скоупс, 1995; Riera et al., 1997). Применяли различные
подходы, в том числе batch-процедуру с использованием ДЕАЕ-целлюлозы
(Whatman 52), ВЭЖХ на колонке Mono Q (FPLC, «Pharmacia-LKB», Швеция) в
линейном градиенте KCl и другие. Для измерения молекулярной массы
исследуемых ферментов использовали метод гель-фильтрации на калиброванной
колонке Superose 6 HR 10/30 в системе FPLC при измерении активности фермента
во фракциях.
Трансметилирование ДНК исследовали путём измерения содержания
метилированных оснований (молярные %) в ДНК бактерии, оценки ДНК-
трансметилазной активности и уровня радиоактивности минорных оснований при
использовании меченых доноров метильных групп.
Статистическую обработку данных проводили используя табличные методы
[Ашмарин и др., 1971]. Вычисляли медиану или среднее арифметическое с
доверительным интервалом при уровне значимости P?0,05. Достоверность различия
показаний «контроля» и «опыта» устанавливали с помощью критерия Стьюдента
для рядов с малым количеством вариант. Число степеней свободы (f) – от 4 до 6.
Различие считали достоверным при уровне значимости P?0,05 [Венчиков, Венчиков,
1974].


Результаты исследований и обсуждение
1. Ионы кобальта и кобаламин в физиологии P. freudenreichii в
«жестких» условиях существования. Впервые проследили концентрационную
зависимость роста прокариотического организма, а именно P. freudenreichii, от
кобальта. Максимальная скорость роста в присутствии воздуха достигалась при
добавлении в глюкозо-минеральную (минимальную) среду CoCl2.6H2O в
концентрации 1,0 мг.л-1. Как увеличение (возможно токсическое действие избытка
ионов металла), так и уменьшение концентрации соли кобальта (далее – кобальта)
приводило к снижению скорости роста культуры (рис. 1). При этом общее
содержание корриноидов в клетках (в стадии активного роста культуры) имело
прямую зависимость от концентрации кобальта. Отсутствие облигатного участия
кобальта в ферментных системах бактерии обсуждено в диссертации. При
субоптимальной его концентрации в среде положительное влияние на рост
культуры оказывал экзогенный кобамид, например Cbl. Поэтому заключили, что
13

зависимость развития бактерии от концентрации добавленного кобальта в
указанных условиях обусловлена именно кобамидами, для биосинтеза которых
ионы кобальта необходимы. Несмотря на то, что без добавления соли кобальта
среда содержит следы ионов металла (микрограммы на литр), после двух-трёх




Рис. 1. Рост P. freudenreichii на минимальной среде в присутствии
воздуха и содержание корриноидов в клетках в зависимости
от концентрации добавленной в среду соли кобальта
Примечание: концентрация CoCl2.6H2O в среде (мг.л-1):
1) – 1,0; 2) – 3,0; 3) – 5,0; 4) – 0,5; 5) – 0,01; 6 – не добавлен.
Стрелкой и цифрами показано содержание суммарных корриноидов
(мкг.г-1 АСБ) в клетках бактерии (72 ч).



пересевов на ней рост культуры прекращался, клетки утрачивали способность к
делению и выглядели филаментными. В этом случае ни добавленный кобальт, ни
Cbl не стимулировали развитие бактерии, что указывало на глубокие, необратимые
изменения в состоянии её метаболизма.
мкг.г-1
Уровень образования корриноидов (˜1000 АСБ), которому
соответствует максимальная скорость роста на минимальной среде при свободном
доступе воздуха, был принят нами как физиологически значимый (нормальный), а
вариант бактерии обозначен как Cor+ (полноценный по содержанию корриноидов в
клетках). Дефицитный по корриноидам вариант (Сor-, остаточное содержание в
клетках ˜ 10 мкг.г-1 АСБ) возобновлял свой рост либо в аноксических условиях,
14

например в присутствии аргона (рис. 2), либо на воздухе, но при дополнении среды
одним их соединений с восстановленной формой серы: тиосульфатом-Nа,
цистеином, метионином, восстановленным глутатионом.



1200
+ метионин

+ тиосульфат
1000
+ метионин
АСБ, мг.л -1 (0 - 24 ч)




800 + тиосульфат

Cor-
600


400


200
Сor--
0
воздух аргон

Рис. 2. Рост дефицитной по корриноидам P. freudenreichii ( Cor-) на
минимальной среде в присутствии воздуха или аргона
Примечание: тиосульфат-Na или метионин добавлены в концентрации 0,03%.


Следовательно, высокий уровень образования корриноидов в клетках имеет
положительное значение для развития P. freudenreichii в присутствии О2, которое
альтернативно может быть поддержано соединениями с восстановленной формой
серы. Помимо прямой нейтрализации О2 в среде не исключается физиологическое
действие этих соединений в антиокислительной защите клеток, дефицитных по
корриноидам. В Сor- варианте бактерии, растущем в условно аноксических условиях
наблюдали усиление потребления ионов сульфата, а также повышенную активность
первых ферментов ассимиляционной сульфатредукции и пентозомонофосфатного
пути, генерирующего НАДФН. Диссимиляционная сульфатредукция у ПКБ не
показана (Vorobjeva, 1999; 2000). Предположили, что в условиях дефицита
корриноидов в клетках P. freudenreichii включаются компенсационные механизмы
15

для поддержания уровня существенных для катализов сульфгидрильных групп. В
литературе (на примере E. coli и клеток млекопитающих) имеются сведения о
соответствии между обеспеченностью клеток витамином В12 и общим уровнем
сульфгидрильных групп в них (Dubnoff, Bartran, 1956; Bhai et al., 1968).
Сравнение уровней сульфгидрильных групп белков Cor+ и Cor- клеток
(варианты культивировали при свободном доступе воздуха на глюкозо-минеральной
среде, дополненной метионином) показало, что общее содержание тиолов в
препаратах белков Cor- клеток на 30 – 35 % снижено по сравнению с таковым Cor+
клеток (рис. 3). Это коррелирует с активностью некоторых ферментов, содержащих
существенные для катализа сульфгидрильные группы (Торчинский, 1971).
Механизмы защиты тиолов белков не изучены, но известно, что алкилированные
корриноиды (кобамиды) способны к образованию слабых комплексов с
восстановленным глутатионом, маскируя его SH-группу от действия кислорода; при
этом ПХМБ с ней взаимодействует (Dubnoff, Phillips, 1959; Dubnoff, 1964; Wagner,
Bernhauer, 1964). Представленные физиолого-биохимические данные, наряду с
литературными сведениями, указывают на необходимость более глубоких
исследований взаимодействия кобамидов, форм кислорода и SH-соединений. Это
область биоорганической и(или) координационной химии.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что для аэротолерантности
бактерии, обладающей в норме активным «флавиновым дыханием» и системой
ФАОЗ, в определённых, «жестких» условиях существования положительное
значение имеют соединения группы витамина В12, корриноиды (кобамиды),
образуемые бактерией в значительных количествах. Представляется вероятным, что
у P. freudenreichii в условиях минимальной среды при свободном доступе воздуха
ферменты, участвующие в нейтрализации молекулярного кислорода и(или) его
токсичных форм, сами нуждаются в защите от инактивирующего действия
кислорода, и фактором этой защиты могут выступать корриноиды. Идея о том, что
предел аэротолерантности P. freudenreichii определён устойчивостью к действию
кислорода ферментной системы поддержания аэротолерантности (флавиновые
оксидазы, цитохромы, СОД и др.) была высказана в 70-х годах прошлого века [De
Vries et al., 1972; Schwartz, 1973; Pritchard et al., 1977]. Показано, что в отличие от P.
16

acidipropionici (P. pentosaceum), тяготеющей к аэробиозу и синтезирующей в норме
примерно в 20 раз меньше корриноидов, у P. freudenreichii, которая очень медленно
растёт в условиях интенсивной аэрации (на богатой среде без добавления соли
кобальта), подавлен биосинтез флавинов и цитохромов [De Vries et al., 1972].
Индукцию синтеза цитохрома d наблюдали только в условиях ограниченной
аэрации [Pritchard et al., 1977].




0,14


0,12
Cor+
? А250 0,1


0,08
Cor-
0,06


0,04


0,02


0
1

0 20 40 60 80 100 120 140 160
Раствор 0,8 мМ ПХМБ, мкл


Рис. 3. Уровни сульфгидрильных групп в белках P. freudenreichii в
зависимости от содержания корриноидов в клетках
Примечание: анализируемые препараты – растворы диализованных
экстрактов клеток в присутствии 8 М мочевины (содержание белка – по 1
мг в 3 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 7,0). При титровании тиолов
использовали щелочной водный раствор ПХМБ (Торчинский, 1971).




Устойчивость P. freudenreichii к летальному действию ультрафиолетовой
радиации (УФ, ?макс 254 нм) также коррелировала с высоким внутриклеточным
17

содержанием корриноидов в клетках. При 25% их остаточном содержании потеря
жизнеспособности клеток, облучённых в суспензии составляла ˜ 80% по сравнению
с полноценными по корриноидам (Cor+). AdoCbl, добавляемый в суспензию
облучаемых клеток (за 12 часов до экспозиции УФ), способствовал значительному
повышению их выживаемости. Устойчивость бактерии к УФ-излучению, по-
видимому, определяется метаболическим состоянием бактерии, которое
обусловлено внутриклеточными корриноидами.
Таким образом, высокий уровень образования корриноидов в клетках P.
freudenreichii имеет положительное значение для её аэротолерантности и УФ-
резистентности в определённых условиях существования, напоминающих таковые
на древней Земле в период появления кислорода. Действие некоторых
низкомолекулярных соединений (вне ферментов) в антиокислительной защите
клеток известно (Скулачёв, 1997).
2. Изменения в физиологии P. freudenreichii при лимитировании по ионам
кобальта в среде и дефиците корриноидов в клетках. Рост P. freudenreichii на
глюкозо-минеральной среде с аммонием как единственным источником азота (в
присутствии воздуха), когда бактерия самостоятельно синтезирует все метаболиты и
полимеры клетки, требуя только биотин и пантотенат, возможен при условии
образования значительных количеств корриноидов в клетках.
Дефицит Cbl в клетках неизбежно лимитирует специфически зависимую от него
метионинсинтазу (Cbl-МСазу), однако нами было установлено, что для нормального
биосинтеза метионина у P. freudenreichii достаточно 100-200 мкг.г-1 суммарных
кобамидов в клетках. При 100- и 1000- кратном их дефиците метионин как
незаменимая аминокислота, как соединение с восстановленной формой серы и как
компонент S-аденозилметионина (S-AdoMet), должен быть получен клеткой либо в
результате функционирования альтернативной МСазы, независимой от Cbl (впервые
это было показано для E. coli; Jeter et al., 1987), либо из среды. Так же могут быть
получены аминокислоты, биогенез которых включает перенос С1 фрагментов при
участии активных форм тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ), освобождение которой
от метильной группы связано с активностью МСазы (Roth et al., 1996).
Дефицитная по корриноидам бактерия при свободном доступе воздуха способна
развиваться со скоростью, равной или близкой таковой Cor+ варианта (табл.1). При
18

этом она испытывает новые ростовые потребности: требует смесь аминокислот и
пептидов (триптон), а её рост уже не зависит от концентрации кобальта в среде и
содержания корриноидов в клетках. Обогащённая триптоном среда содержит
аминокислоты с восстановленной формой серы, благодаря чему, видимо, бактерия
«решает проблему» аэропротекции при дефиците корриноидов.

Таблица 1. Удельные скорости роста вариантов P. freudenreichii,
различающихся по содержанию корриноидов в клетках, на
минимальной и обогащенной средах

Удельная скорость роста (µ), ч-1
Вариант культуры
24 - 48 ч 48-72 ч
Cor+ ,
минимальная среда
+ CoCl2.6H20, 1 мг.л-1,
содерж. корриноидов ˜ 1000 мкг.г-1 АСБ 0,0510 ± 0,0030 0,0285 ± 0,0027

Cor+ ,
обогащённая триптоном среда
+ CoCl2.6H20, 3 мг.л-1,
содерж. корриноидов ˜ 1000 мкг.г-1 АСБ 0,0518 ± 0,0020 0,0288 ± 0,0014

Cor-,
обогащённая триптоном среда,
содерж. корриноидов ˜ 10 мкг.г-1 АСБ 0,0520 ± 0,0026 0,0279 ± 0,0018

Cor=,
обогащённая триптоном среда,
содерж. корриноидов ˜ 1 мкг.г-1 АСБ 0,0512 ± 0,0023 0,0281 ± 0,0014


Примечание: данные представляют собой медиану (Ме) для 6 повторностей и её
доверительный интервал. Триптон добавлен в концентрации 0,03%.


Присутствие смеси аминокислот в среде наряду с резким падением уровня
образования корриноидов ведёт к определённому снижению затрат энергии клеткой,
но происходят ли изменения в основном энергетическом процессе P. freudenreichii
– пропионовокислом брожении, при дефиците корриноидов?
Результаты сравнительного анализа основных продуктов ПБ показали, что при
100-кратном дефиците корриноидов в клетках бактерии, растущей на обогащённой
(триптоном) среде, характер брожения не изменяется: количество и соотношение
(2:1) выделяемых в среду пропионовой и уксусной кислот сохраняются. Это
19
свидетельствует о нормальном функционировании метилмалонил-КоА-мутазы
(ММКоАМазы) – ключевого фермента ПБ, использующего в качестве кофермента
не только Cbl, но и любой другой кобамид, вкючая кобинамид (Overath et al., 1962;
Chowdhury et al., 2001). Кобинамид (Cbi) или безнуклеотидный фактор В –
преобладающий корриноид в клетках бактерии, причём более 80% Cbi находится в
аденозилированной форме, AdoCbi (Быховский, Зайцева, 1989; Krautler, 1998).
Интенсивность потоков вещества в брожении меняется только при глубоком, 1000-
кратном, дефиците корриноидов (остаточное содержание 0,1% или ˜1 мкг.г-1 АСБ,
вариант обозначили как Cor=). Усиливается образование уксусной и снижено
образование пропионовой кислоты, но и это (теоретически) не является критичным
для энергообеспечения клеток, что подтверждается близостью скоростей роста на
обогащённой среде всех трёх вариантов бактерии (Cor+, Cor-, Cor=).
Таким образом, установлено, что высокий уровень образования корриноидов не
является необходимым для ПБ. Вместе с тем при 1000-кратном снижении уровня
образования корриноидов (Cor= вариант) бактерия, видимо, действительно
перестраивает обмен, о чём судили по временному замедлению роста культур на
обогащённой триптоном среде под влиянием экзогенного Cbl.
Какой же из процессов специфически зависит от Cbl, но может протекать
альтернативно, без его участия? Учитывая собственные наблюдения повышенной
чувствительности к УФ-излучению лимитированных по содержанию корриноидов
клеток P. freudenreichii (основной мишенью воздействия является ДНК) и принимая
во внимание предшествующие работы, показывающие связь между присутствием в
среде витамина В12 (или ионов кобальта) и содержанием ДНК (но не РНК), в
клетках Lactobacillus leichmanii [Wacker et al., 1957; Beck et al., 1962], Rhizobium
meliloti [Cowles et al., 1969] и Euglena gracilis [Johnston, Carell, 1973; Christopher et
al., 1974], внимание направили на исследование анаболизма ДНК P. freudenreichii в
связи с разными уровнями образования кобамидов в клетках.
Установили, что полноценные (Cor+) и дефицитные (Cor-, 100-кратный дефицит)
по содержанию кобамидов клетки почти двукратно различаются по содержанию
ДНК, но не РНК (Иордан и др., 1983), причём тогда, когда скорости роста
физиологических вариантов бактерии близки. Снижение содержания ДНК на 40% в
расчёте на клетку) наблюдали также в бактероидах клубеньков люпина,
20
выращенного при недостатке ионов кобальта, и имеющих пониженное содержание
кобаламина [Dilworth, Bisseling, 1984].
Следовательно, показанная выше корреляция, имеет определённое
распространение среди микроорганизмов. Она подтверждает непостоянство




3000



2500
ДНК, имп.мин-1.мг-1 (АСБ), за 40 мин




2000



1500



1000



500



0
- 0,01 0,05 0,5 1,0 3,0 4,0
CoCl2.6H20, мг.л-1

10 100 200 600 900 1100 1250
Эндогенные корриноиды (по СN-Cbl), мкг.г-1

Влияние ионов кобальта на интенсивность образования ДНК в
Рис. 4.
клетках P. freudenreichii. Корреляция с содержанием эндогенных
кобамидов

Примечание: отмытые клетки фазы активного роста культуры суспендировали и
концентрировали (5 мг.мл-1 по АСБ) в солевом фоне среды с добавлением 0,5%
глюкозы при 6оС. Суспензии вариантов уравнивали по А540.
Вводили [3Н]аденин, 74 МБк.мл-1 (уд. радиоактивность – 592 МБк .ммоль-1) и
немеченый аденин, 5 мкг.мл–1. Инкубирование - 40 мин при 37оС.
Контроль «0-времени» – радиоактивность ДНК через 5 мин инкубирования.
Представлены результаты типичного из 4-х опытов; позиции диаграммы – средние
значения (Me) для 5 повторных измерений. Отклонения – в пределах 10%.
21
содержания ДНК в прокариотической клетке и затрагивает вопрос о его
биологическом смысле, обсуждение которого приведено в диссертации (глава 4).
От концентрации соли кобальта в среде зависела интенсивность образования
ДНК (тотальный синтез ДНК, определяемый как скоростью элонгации репликации,
так и числом репликативных вилок). В клетках экспоненциально растущих
вариантов (при практически равных скоростях роста) она коррелировала с
содержанием корриноидов; значительное снижение интенсивности процесса
происходило при небольшом его уменьшении (рис. 4).

Действие аденозилкобаламина на образование ДНК в клетках
Таблица 2.
P. freudenreichii (Cor- вариант) в условиях подавления синтеза
РНК и белка

Интенсивность образования ДНК, Показатель
Вариант -1 -1 -1
имп.мин (ДНК) . мг (АСБ) . 10 мин стимулирующего
эффекта (N)
Контроль (Сor-) 1500
2,16
то же + AdoCbl 3240

Cor- + рифампицин 470
2,00
то же + AdoCbl 1034

Cor- +хлорамфеникол 615
2,20
то же + AdoCbl 1230


Примечание: суспензия клеток (5 мг.л-1, по АСБ) – отмытые от среды клетки 65-ч
культуры в инкубационном растворе (солевой фон среды + 0,5% глюкоза). Инкубирование
– 90 мин, 37оС. AdoCbl – 3 мкг.мл-1. Рифампицин (200 мкг.мл-1) и хлорамфеникол (100
мкг.мл-1) вводили в суспензию за 10 мин до AdoCbl. В соответствии с критерием
Стьюдента для рядов с малым числом вариант различия сравниваемых показаний
достоверны (Р ? 0,05, f = 4).


Впервые в серии экспериментов с P. freudenreichii было доказано прямое и
специфическое участие кобаламина в анаболизме ДНК. Так, показана
интенсификация образования ДНК в суспензии Cor- клеток под действием AdoCbl и
MeCbl, причём в результате введения Cbl процесс протекал даже более интенсивно,
чем в Cor+ клетках (рис. 5). Последнее указывает на его метаболическое
лимитирование эндогенным Cbl даже при физиологически нормальном уровне
22
суммарных корриноидов в клетках бактерии (производные Cbl взаимопревращаемы
in vivo). Введение Cbl (рис. 6) или 5,6-ДМБ (Иордан и др., 1994) в суспензию Cor+
клеток также приводило к ускорению процесса. Это объясняется энзиматическим




30 -
Радиоактивн. ДНК, 103 имп.мин –1. мг-1(АСБ)




Cor - + AdoСbl
25 -

Cor - + MeСbl
20 -


15 -


10 -


5-


0- i i i i i
20 40 60 80 100
Время, мин


Интенсификация образования ДНК в Cor- клетках P. freudenreichii
Рис. 5.
под действием аденозил- или метилкобаламина

- вариант Cor+;
Обозначение:

Примечание: в охлаждённые суспензии сконцентрированных клеток (фаза активного роста)
введён [8-14С]аденин – 74 КБк.мл-1 (удельная радиоактивность – 10,2 ГБк.г-1) и аденин – 5
мкг.мл-1. Преинкубирование с корриноидами 15-20 мин при 37оС. Концентрация
кобаламинов – 3 мкг.мл-1. 0-точка – радиоактивность ДНК через 5 мин инкубирования при
37о С (вычтена из показаний опыта).


превращением кобамидов в кобаламин в клетках после поступления в них 5,6-ДМБ
(Быховский, Зайцева, 1989). Наконец, мы оценили эффект AdoCbl на образование
ДНК в суспензии клеток («острый опыт») при подавлении биосинтеза РНК и белка.
Несмотря на снижение интенсивности процесса в присутствии рифампицина или
хлорамфеникола, вероятно, из-за подавления инициации репликации, показатель
23
интенсификации образования ДНК под действием AdoCbl в суспензии Cor- клеток
сохранялся (табл. 2).

30000




25000
Радиоактивность ДНК, имп.мин-1 . мг-1(АСБ)



3
20000 2


15000

1

10000




5000




0


0 20 40 60 80
Время, мин

Рис. 6. Интенсификация образования ДНК в Cor+ клетках под действием
аденозилкобаламина

Обозначения: 1 – Cor+, контроль (без добавления AdoCbl);
2, 3 – добавлен AdoCbl: 3,0 и 9,0 мг.л-1 соответственно.
Примечание: условия постановки опыта см. на рис. 5.
Здесь удельная радиоактивность меченого аденина – 12,7 ГБк .г-1.


Следовательно, на биосинтез ДНК кобаламин действует специфически, по-
видимому, – на уровне элонгации репликации. Стимулирующее влияние AdoCbl на
интенсивность образования ДНК в клетках выявлено для представителей других
видов классических ПКБ и кожной бактерии P. acnes, а также для некоторых
стрептомицетов, синтезирующих в норме Cbl в значительных количествах. AdoCbl
не оказывал влияния на образование ДНК у E. coli. Интенсивность образования РНК
24
в клетках всех анализируемых штаммов ПКБ не зависела от AdoCbl (Иордан и др.,
1990).
Удивительным оказался тот факт, что P. freudenreichii не прекращала
образования ДНК, например, в отличие от Rhizobium meliloti (Cowles et al., 1969),
при самом тщательном освобождении среды от ионов кобальта. Мы соприкоснулись
с «аномальным явлением»: с одной стороны, зависимостью процесса от кобаламина,
а c другой, – его осуществлением практически в отсутствие корриноидов, причём
экзогенный AdoCbl действовал в последнем случае как ингибитор (рис. 7).
Седовательно, при глубоком дефиците корриноидов происходит изменение
характера биосинтеза ДНК.
Действительно, только в Cor= клетках образование ДНК происходило
интенсивнее, если культура росла в присутствии воздуха; гидроксимочевина (ГМ,
специфический ингибитор металлосодержащих, активируемых О2 РНРаз, см. далее)
подавляла процесс. Ионы Mn2+ (в суспензии клеток культуры Cor=, выращенной на
среде, предварительно освобождённой от ионов Mn2+) стимулировали его (рис. 8).
Внимание именно к ионам марганца обусловлено имеющимися в литературе
сведениями об их значении для процесса в клетках некоторых коринеформных
бактерий (Auling et al., 1980; Auling, Follmann, 1994), к которым относятся и ПКБ.
Удаление из «бескобальтовой» среды ионов марганца приводило к снижению
скорости роста культуры; клетки становились примерно в 5 раз длиннее исходных.
После добавления марганца состояние бактерии нормализовалось. Удлинение
клеток и снижение скорости роста Сor= культуры при нормальной концентрации
хлористого марганца в среде происходило и под влиянием ГМ. Ранее значение
ионов Mn2+ было показано для Nocardia opaca, C. ammoniagenes и Arthrobacter spp.,
которые в отсутствие марганца также прекращали синтез ДНК и переходили к
филаментному росту (Auling et al., 1980; Plonzig, Auling, 1987).
Таким образом, бактерия способна синтезировать ДНК как с участием, так и без
участия кобаламина, используя, по-видимому, марганец; причём в последнем случае
кобаламин подавляет процесс. В физиологии микроорганизмов двойственность
процесса описана впервые.


.
25




A


-
24 -
Скор. включ. в ДНК, 10 2 имп. мин-1. мг–1(АСБ) . 10 мин -1




-
16 -
-
8-
-
0- i i i i i
˜ 1000 ˜ 100 ˜ 10 4-2 ˜1
Корриониды (по CN-Cbl), мкг.г -1



Б


+ AdoCbl
+ AdoCbl
в -
* 24 -
-
16 -
-
8-
-
0
1 2 1 2

Интенсивность образования ДНК в клетках P. freudenreichii в
Рис. 7.
зависимости от содержания корриноидов (А) и под влиянием
аденозилкобаламина (Б)

Обозначения: - скорость включения меченого аденина в ДНК
суспензии клеток без экзогенного кобаламина
- то же с добавлением AdoCbl (1. – 0,3 мг.л-1; 2. – 3,0 мг.л-1)

Примечание: условия опыта см. примечание к рис. 5.
26

MnCl2.4H2O,
14000 -
мкM
А
-
-
-
12000 - 1,5
-
-
3,0
-
а
10000 -
контроль
-
-
-
8000 -
-
Радиоактивность ДНК, имп. мин –1.мл -1




- б
-
6000 - 5,0
-
-
10,0
-
4000 -
-
-
-
2000 -
-
-
-
0- i i i i
Время, мин
15 30 45 60
14000 -
Б
-
MnCl2.4H2O, µM
-
-
12000 - 1,5
-
-
-
10000 -
а контроль
-
-
-
8000 -
-
Обозначения: контроль – без добавления соли
-
б
-
марганца или гидрокcимочевины (ГМ). Примечание:
6000 -
условия постановки опытов (но без Cbl) см. на рис. 5
-
и 6. Различие между включениями в ДНК (за 60
-
мин) в позициях «а» и «б» достоверны при уровне а + ГМ (80 мМ)
-
значимости P? 0,05 4000 -
(f=4). б + то же
-
-
-
2000 -
-
Образование ДНК в клетках
Рис. 8
-
P. freudenreichii при 1000-кратном
-
0- i i i i
дефиците коррионидов и
15 30 45 60
лимитированных по марганцу
под влиянием ионов марганца (А)
и гидроксимочевины (Б)
27
3. Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P.
freudenreichii при участии кобаламина. В литературе отсутствуют сведения об
участии кобаламина в ферментных системах собственно репликации хромосомы.
Для выявления точек его приложения к процессу образования ДНК у P.
freudenreichii, исследовали возможность его вовлечения в формирование
предшественников ДНК, а также в её метилирование.
Данные проведённых экспериментов показали, что Cor- клетки (100-кратный
дефицит корриноидов) P. freudenreichii лимитированы по тиминовому
предшественнику ДНК. Так, при попытке использования [3Н]тимина в качестве
азотистого основания, метящего ДНК, наблюдали бoльший прирост её удельной
радиоактивности в растущей Cor- культуре по сравнению с Cor+. Известно, что
голодающие по тимину клетки, используя запасный путь для формирования пула
дТТФ, включают экзогенный тимин в ДНК интенсивнее, чем полноценные по нему
(Mollgaard, Neuhard, 1983; Mathews, 1985). В таком случае тимин не является
нейтральной меткой, адекватно регистрирующей синтез ДНК. Поэтому для
наблюдения за процессом в качестве метки использовали аденин. Положительное
влияние экзогенного тимина на образование ДНК в дефицитных по корриноидам
клетках проявлялось. Не исключен побочный эффект дефицита Cbl, который,
непосредственно участвуя в Cbl-зависимой реакции синтеза метионина, косвенным
образом влияет на активность тимидилатсинтазы (возможно, она лимитирована по
ТГФ, освобождаемой от СН3-группы в МСазной реакции). Однако введение тимина
не устраняло различие Cor- и Cor+ клеток в интенсивности образования ДНК.
Поэтому заключили, что возможное опосредованное влияние кобаламина на синтез
тимидилата – не единственная и не критическая точка его приложения к процессу.
РНРаза ответственна за сбалансированное превращение 4-х рибонуклеотидов в
соответствующие дезоксирибонуклеотиды. Это первая специфическая и
скоростьлимитирующая ступень в анаболизме ДНК у всех организмов. Фермент как
контролирующий репликацию относят к генетическим (Нu et al., 1984; Cory, 1988;
Chiu et al., 1992; Reichard, 1993; Licht et al., 1996). РНРазу обнаруживают в ДНК-
мембранных комплексах, её синтез приурочен к началу репликации ДНК (cell cycle
regulated enzyme), а подавление биосинтеза ДНК любым способом вызывает
дерепрессию синтеза фермента (Sun, Fuchs, 1992). Незначительные изменения
28
активности фермента немедленно отражаются на интенсивности образования ДНК
(Sinha, Snustad, 1972; Brischwein et al., 1997), поэтому РНРазу используют как
мишень в противораковой терапии (Chiu et al., 1992; Fan et al., 1996).
Известно несколько типов РНРаз, различающихся по строению коферментной
части молекул и способу образования свободных радикалов в активных центрах
(Licht et al., 1999; Oehlmann, Auling, 1999; Reichard, 1993; 2001). У прокариот
наиболее широко распространена AdoCbl-зависимая РНРаза (Рыжкова, 2003),
которая к началу наших исследований (1972 г.) была открыта и частично изучена у
L. leichmanii (Blakley, Barker, 1964; Blakley et al., 1965; Panagou et al., 1972), R.
meliloti (Cowles, Evans, 1968; Cowles et al., 1969) и E. gracilis (Hamilton, Blakley,
1969). Кроме того, с помощью специального теста AdoCbl-РНРаза была предсказана
(Gleason, Hogenkamp, 1972) для некоторых других бактерий разных родов (но не
Propionibacterium).
В бесклеточных системах P. freudenreichii, в норме синтезирующей корриноиды
(вариант Cor+), мы выявили активность РНРазы (Иордан и др. 1975), которую
стимулировал AdoCbl. Она требовала Гл-SH, не зависела от ионов Mg2+, не
сопровождалась потреблением молекулярного кислорода, не подвергалась
ингибированию ГМ. Активность подавлял «внутренний фактор» (ВФ, intrinsic
factor) – специфический ингибитор Cbl-зависимых ферментов (Nexo, 1998). В
экстрактах Cor- клеток активность абсолютно зависела от AdoCbl (рис. 9).
Функциональные свойства РНРазы P. freudenreichii (табл. 3) cоответствовали
таковым других, известных, AdoCbl-зависимых РНРаз (Blakley, 1982; Иордан, 1990;
Harder, 1993, Рыжкова, 2003). Наличие РНРазы, зависимой от AdoCbl, в клетках P.
freudenreichii показано также методом ЭПР-спектрометрии по возрастанию
интенсивности сигнала, характерного для AdoCbl-зависимых ферментов, прямо
пропорционально активности РНРазы. Присутствие AdoCbl в составе РНРазы
подтверждено реконструкцией холофермента с помощью AdoCbl, о чём судили по
восстановлению активности, теряемой в процессе выделения и очистки фермента.
Получены данные, свидетельствующие об участии глутаредоксина в качестве
естественного восстановителя в системе AdoCbl-зависимой РНРазы Cor+ клеток:
восстановленный глутатион, но не НАДФН, обеспечивал активность фермента.
29




Начальная скорость РНР-реакции, нмоль . мг –1. ч -1



120

Cor+
100


80

Cor-
60


40


20



0 5 10 15 20 25
AdoCbl, мкM


Зависимость начальной скорости РНР-реакции, катализируемой
Рис 9.
AdoCbl-зависимой РНРазой P. freudenreichii, полноценной (Cor+)
и дефицитной (Cor-) по корриноидам, от концентрации AdoCbl

Примечание: варианты бактерии культивировали 72 ч на глюкозо-
минеральной среде, обогащённой триптоном (0,05%), с добавлением
CoCl2.6H2O, 1 мг.л-1 (Cor+) и без кобальта (Cor-), остаточное
содержание корриноидов ˜ 10 мкг.г-1 АСБ.
Реакционная смесь содержала: 70 мМ трис-HCl буфер (рН 7,0);
АДФ – 0,7 мМ; ДТТ – 30 мМ; диализованный экстракт клеток (800 мкг,
по белку). Объём – 200 мкл. Инкубирование – 30 мин при 37оС.
Кинетические параметры реакции, катализируемой AdoCbl-зависимой РНРазой в диализованных
Таблица 3.
экстрактах клеток P. freudenreichii (Cor+ и *Cor– вариантов) в оптимизированной реакционной смеси


КМ Кv Компоненты реакционной смеси, KМ , мМ КМ ,
Максимальная Отно-
Отношение к
(c АДФ)
(для АДФ с ДТТ) мкМ
мМ
начальная скорость РНР- шение
ингибиторам (I 50%)
для
Вариант Вариант
реакции (Vmax) ** к О2
с Гл-SH
нм . мг-1.ч –1 мМ .ч-1 ч -1 Mg 2+
НАДФН
мМ АДФ ДТТ Гл-SН ГМ ВФ ДТТ Гл-SH для
AdoCbl




не влияет
без AdoCbl
Cor + Не 2,5 Инерт. 7,0 0,5 -
+
Cor ингибирует -1
80 (с ДТТ) мг.мл
0,32 0,20 0,8 30 8,0 нет
0,6-0,7

Не
Cor- Инерт. - - 7,5
ингибирует
60 (с Гл-SH) +
AdoCbl,
2- 20 мкМ


Сor+: в клетках содержится корриноидов ˜ 1000 мкг . г-1 АСБ;
Примечание.
Сor-: в клетках содержится корриноидов ˜ 10 мкг . г-1 АСБ (* в реакционной смеси присутствует AdoCbl);
рН-оптимум = 7,0

ГМ – гидроксимочевина – специфический ингибитор гетеродимерных металлосодержащих РНРаз, активируемых мол. кислородом.
ВФ – «внутренний фактор» (ВФ, IF, intrinsic factor ) – высокоспецифичный Cbl-связывающий белок в составе белкового комплекса
желудочного сока, неконкурентный ингибитор Cbl-зависимых ферментов. Любезно предоставлен проф. E. Nexo, Дания [Nexo, 1998].
10 мг препарата связывает 0,8 нмолей кобаламина;
Гл-SH – восстановленный глутатион; ДТТ- дитиотреитол;
Кv – константа скорости реакции;
- (прочерк) – измерение не проводили.
** При введении дГТФ в реакционную смесь активность возрастала ˜ на 50%.



126
31
Данные (in vitro), представленные на рис. 9, и повышение удельной активности
AdoCbl-РНРазы в результате введения в суспензию Cor+ клеток Cbl или 5,6-ДМБ
(Иордан и др., 1994) свидетельствуют о том, что AdoCbl-РНРаза метаболически
лимитирована по Cbl даже в норме (при высоком уровне образования корриноидов).
Причинами этого, по-видимому, являются строгая специфичность РНРазы к Cbl
(Schneider, Stroinski, 1987; Lawrence et al., 1999) и низкое содержание Сbl в клетках в
норме как особенность регуляции биосинтеза корриноидов (Быховский, 1979;
Bykhovsky еt al., 1997). Вышесказанное объясняет необходимость высокого уровня
образования корриноидов в клетках P. freudenreichii для эффективного биосинтеза
ДНК и стимулирующее влияние экзогенного Cbl на процесс при нормальном
(физиологическом) содержании корриноидов.
Предположение о том, что в природе помимо универсального механизма
метилирования макромолекул, действующего через S-AdoMet, существует
обособленный путь трансметилирования при участии MeCbl, высказывалось давно.
Предпосылки обобщены в монографии (Канопкайте, Рачкус, 1991). Стимулирование
витамином В12 включения СН3-группы из метилметионина (витамина U) в ДНК
было известно для E. gracilis (Bertaux, Valencia, 1975). Среди изученных бактерий
высокометилированную по цитозину ДНК содержат P. freudenreichii и Alcaligenes
faecalis при том, что обычно у бактерий 5-метилцитозин (м5С) в ДНК встречается
значительно реже (Ванюшин, 1968), чем 6-метиладенин (м6А). Имеются сведения о
значении метилирования ДНК именно по аденину для контроля репликации в
бактериальной клетке; метилирование ДНК по цитозину существенно для других
процессов, таких как экспрессия генов, защита генома от действия рестриктаз,
репарация ДНК и другие (Кирнос и др., 1993; Lengeler et al., 1999). P. freudenreichii
содержит MeCbl (Skupin et al., 1970).
Мы наблюдали двукратное различие в уровнях м5С ДНК Сor+ и Cor- вариантов
P. freudenreichii. В бесклеточных системах Cor+ варианта выявлена активность
фермента, катализирующего трансметилирование цитозина ДНК, который
специфически использовал MeCbl в качестве донора метильной группы (табл. 4). В
Cor- препарате была активна дублирующая метилтрансфераза (МТР) цитозина,
требующая S-AdoMet, но не MeCbl в качестве донора метильной группы. Работами
32
французских исследователей с эукариотными клетками получены данные,
подтверждающие возможность метилирования ДНК по цитозину не только
посредством S-AdoMet, но и MeCbl (Pfohl-Leszkowicz et al., 1991).

Таблица 4. Метилкобаламин в энзиматическом метилировании ДНК
(по цитозину) P. freudenreichii

Реакционная смесь содержит:
м5С в ДНК, М %
Корриноиды Cor + (контроль) Cor -
препарат МТР
- - 0,59 + 0,05 0,28 + 0,04

стр. 1
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ

>>