<<

стр. 2
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ

Ў MeCbl 0,62 + 0,06 0,60 + 0,05
- MeCbl 0,61 + 0,04 0,35 + 0,03
Ў - 0,59 + 0,04 0,29 + 0,03
Ў AdoCbl 0,58 + 0,03 0,27 + 0,05
Ў Фактор В 0,60 + 0,06 0,26 + 0,04
Ў+ CF2Cl-Cbl MeCbl 0,61 + 0,07 0,35 + 0,05
MeCbl 0,57 + 0,05 0,39 + 0,06
Ў+S-аденозилгомоцистеин




Обозначения: Ў добавлен; - не добавлен
Примечание: Сor+ вариант выращен на минимальной среде; Cor- – при добавлении в неё
тиосульфата-Na. Реакционная смесь (10 мл) содержала: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,0;
препарат МТР (экстракт Cor+ клеток после ультрацентрифугирования,105000g (7 мг по
белку); корриноиды – по 5 мкмолей; акцепторную ДНК из Cor- клеток, 10 мг.
Инкубирование – 90 мин при 37оС. CF2Cl-Cbl – неконкурентный ингибитор МТР от MeCbl
(5мкм); S-аденозилгомоцистеин – конкурентный ингибитор МТР от S-AdoMet (5 мкм).


У обоих вариантов P. freudenreichii S-AdoMet служил донором СН3-группы
группы при трансметилировании аденина ДНК (табл. 5). Образование
метилированного аденина, существенного для контроля репликации у бактерий, не
требует MeCbl, поэтому для биосинтеза ДНК в клетках изучаемой бактерии
выявленный эффект MeCbl не должен иметь значения.
Таким образом, впервые показано трансметилирование ДНК, зависимое от
метилкобаламина как донора метильных групп. В клетках P. freudenreichii оно
происходит по цитозину ДНК, причём альтернативно, в отсутствие
метилкобаламина, используется S-AdoMet.
33


Таблица 5. Метилирование гетерологичной ДНК от MeCbl или S-AdoMet
препаратами метилаз Cor+ и Сor- клеток P. freudenreichii


Примечание: препараты МТР – диализованные гомогенаты клеток бактерии. Субстрат –

Препарат МТР Радиоактивность оснований ДНК по метильной группе,
имп .мин–1 (в 50 мкг ДНК)
м6А м5С
от AdoMet от MeCbI от AdoMet от MeCbI
Cor + 5100 150 100 640
Cor - 7800 200 8050 120
гетерологичная ДНК, метилированная в последовательностях, отличных от бактериальных.
Использованы меченые тритием по СН3-группе S-AdoMet (коммерческий) и MeCbl
(cинтезирован в лаборатории и обладал невысокой удельной радиоактивностью).


4. Альтернативная рибонуклеотидредуктаза P. freudenreichii,
функционирующая в процессе образования ДНК без участия кобаламина.
Способность бактерии синтезировать ДНК в отсутствие Cbl могла быть обусловлена
функционированием в клетках альтернативной, независимой от AdoCbl, РНРазы
наряду с другими ферментами анаболизма ДНК, действующими вне связи с
корриноидами. До наших исследований уже была известна Fe-содержащая и
активируемая О2 РНРаза E. coli (Reichard, 1962; 1967; Eliasson et al., 1986). Это был
новый, впервые открытый фермент. Позже в клетках E. coli, растущей анаэробно,
обнаружили другую РНРазу, чувствительную к кислороду и требующую S-AdoMet
(Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989; Reichard, 1993). Затем сообщили о
чувствительной к О2 («анаэробной») РНРазе M. thermoautotrophicum, ингибируемой
S-AdoMet (Hogenkamp et al., 1987; Sze et al., 1992), и о Mn-содержащей РНРазе,
активируемой О2, в клетках Corynebacterium ammoniagenes и других
коринеформных бактерий (Schimpff-Weiland, Follmann, 1981; Plonzig, Auling, 1987;
Auling, Follmann, 1994; Oehlman, Auling, 1999), а также Bacillus subtilis (Mohamed et
al., 1998).
В настоящее время все известные РНРазы относят к 3-м (или 4-м) классам.
AdoCbl-зависимый фермент (класс ??) наиболее просто устроен: содержит одну
каталитическую субъединицу (R) и коферментную часть – AdoCbl, однако
34
некоторым AdoCbl-РНРазам свойственна гомодимерная структура. Эти ферменты
не вовлекают кислород в катализ, но активны в его присутствии.
Металлосодержащие РНРазы (классов ? и ?V) гетеродимерны (R1-R2), причём легко
диссоцирующую субъединицу R2, несущую металл (Fe или Mn), условно, по
функции, аналогичной AdoCbl, рассматривают как кофермент РНРазы (Reichard,
1993; 2001; Auling, Follmann, 1994; Stubbe, Van der Donk, 1995; Oehlman, Auling,
1999). Молекулярный кислород, активируемый двухядерным кластером металла,
участвует в генерации органического радикала (тирозила) в активном центре
фермента (в литературе эти РНРазы называют «аэробными»), что сопровождается
образованием О2-, которые удаляет СОД (Eliasson et al., 1986). ГМ действует как
тушитель свободного радикала тирозила (Rosenkranz et al., 1966; Reichard, 1993;
Harder, 1993; Auling, Follmann, 1994), который в цепи свободнорадикальных
превращений в активном центре фермента предшествует каталитически
активному (тииловому) радикалу, непосредственно вступающему во
взаимодействие с рибозой нуклеотида. Долгое время считали, что один организм
обладает РНРазой одного типа, и ставился вопрос, не является ли тип РНРазы у того
или иного организма его филогенетическим признаком (Auling, Follmann, 1994).
Первые данные о функционировании в клетках P. freudenreichii независимой от
кобаламина РНРазы, наряду с AdoCbl-РНРазой, были опубликованы нами в 1975
году. Максимальная начальная скорость реакции in vitro требовала новых условий
(табл. 6) в отношении рН-оптимума, потребности в ионах Mg2+, H-доноре и других.
НАДФН, но не Гл-SH, обеспечивал активность альтернативной (дублирующей)
РНРазы. ГМ её подавляла, но активность была устойчива к действию ВФ. По мере
освобождения клеток от корриноидов активность альтернативного фермента (а-
РНРазы) возрастала; в диализованных гомогенатах она была наибольшей, когда
остаточное содержание корриноидов в них составляло порядка 1 мкг.г-1 АСБ (Cor=
вариант). Это соответствовало наибольшей интенсивности образования ДНК в
условиях глубокого дефицита корриноидов. AdoCbl ингибировал активность а-
РНРазы (рис. 10). Данные об ингибирующем действии Cbl в отношении активности
какой-либо РНРазы получены впервые, а в настоящем контексте они служат
объяснению причины подавляющего действия Cbl на синтез ДНК в Сor= клетках P.
freudenreichii.
35


Кинетические параметры РНРазы диализованных гомогенатов Cor-
Таблица 6.
клеток Р. freudenreichii в оптимизированной реакционной смеси


(для АДФ)
Максимальная
Вариант
Компоненты реакционной смеси, мМ
начальная скорость KМ Kv
РНР-реакции, (c ДТТ) Mg2+
АДФ ДТТ Гл-
НАДФН
SH
-1 -1 -1 -1
нм.мг .ч мМ.ч мМ ч



Cor- 45 0,18 0,64 0,13 2,5 - 3,0 27-30 – 2,0 2,5


Трис-HCl буфер (70 мМ), pH-оптимум –
7,9–8,0; белок = 4 мг.мл-1; 37оС; время
инкубирования 40 мин


Примечание: Cor- – остаточное содержание корриноидов составляет ˜10 мкг.г-1 АСБ.


Присутствие воздуха в реакционной смеси требовалось для активности
альтернативного фермента: в атмосфере инертного газа его активность составляла
менее 4%, в то время как AdoCbl-зависимая РНРаза не изменяла уровень
активности. Не исключено, что в процессе реакции происходит специфическое
поглощение O2, которое можно зарегистрировать. Эти результаты показали, что
независимая от Cbl (альтернативная) РНРаза P. freudenreichii относится к классу
«аэробных» рибонуклеотидредуктаз, и послужили объяснению положительного
влияния кислорода (воздуха) на синтез ДНК в Cor= клетках. Проявление активности
а-РНРазы с НАДФН и её отсутствие c Гл-SH (в диализованных экстрактах Cor=
клеток) указывало на функционирование тиоредоксина в качестве естественного
восстановителя системе.
Установили, что а-РНРаза, как и AdoCbl-зависимый фермент Cor+ варианта,
является растворимым в цитоплазме белком, но ˜ 20% её активности ассоцировано с
ЦПМ. Связь с мембраной непрочная, по-видимому, временная пространственно-
функциональная, возникающая во время репликации.
Фермент был выделен и частично очищен (в 826 раз по белку и в 36 раз по
активности). Выделение и очистка а-РНРазы включала обработку экстрактов клеток
сульфатом стрептомицина, фракционирование белкового препарата с помощью
36
неколоночной хроматографии (batch-процедура) и хроматографию в линейном
градиенте КСl на колонке Mono Q в системе FPLC. На последнем этапе очистки
терялась бoльшая часть активности, что происходило и с другими известными
гетеродимерными РНРазами. В процессе гель-фильтрации, применяемой для оценки
молекулярной массы в частично очищенном препарате, наблюдали диссоциацию
фермента на субъединицы, близкие по размеру (90 – 100 кДа), но,
предположительно, разные по строению.
нмоль . мг –1. ч -1




50


40
Начальная скор. РНР-реакции,




30


20


10


0
5 10 15 20 25 30
AdoCbl, мкМ

Рис 10. Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой
альтернативной РНРазой в бесклеточной системе P.
=
freudenreichii, дефицитной по корриноидам (вариант Cor ), от
концентрации AdoCbl

Примечание: культура росла 72 ч на очищенной от ионов кобальта глюкозо-
минеральной среде, обогащённой триптоном (0,05%). Остаточное содержание
корриноидов ˜ 1 мкг.г-1 АСБ. Реакционная смесь содержала: 70 мМ трис-HCl буфер
(рН 8,0); АДФ – 2,5 мМ; ДТТ – 30 мМ; диализованный экстракт клеток (800 мкг, по
белку). Объём – 200 мкл. Инкубирование – 40 мин при 37оС.



Двухкомпонентное строение а-РНРазы подтверждено целенаправленным
разделением фермента с помощью ступенчатой хроматографии на колонке Mono Q
37
и реконструкцией холофермента в результате соединения двух белковых частей,
которые порознь активны не были. В результате исследования влияния ионов
металлов: Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+ и Со2+, на активность РНРазы в частично очищенном
препарате, который был предварительно мягко, путём диализа, обработан 1 мМ
ЭДТА, показали, что специфическим металлом, абсолютно необходимым для
активности а-РНРазы является марганец (рис. 11). Ионы магния, в меньшей степени
активируя фермент, участвуют, по-видимому, в ассоциации субъединиц.




250 -
Активность РНРазы, нмоль. мл–1. ч-1




200 -


150 -


100 -


50 -


0 i i i i i i i
1 2 3 4 5 6 7

Отдельное и совместное влияние ионов марганца и магния на
Рис. 11.
активность альтернативной РНРазы из Cor= клеток P. freudenreichii

Обозначения: (1) – контроль (до обработки ЭДТА); (2 – 7) – после
обработки ЭДТА; (3) + Mg, 0,4 мМ; (4) + Mg, 2,0 мМ; (5) + Mn, 0,2
мМ; (6) + Mn, 0,2 мМ + Mg, 0,4 мМ; (7) + Mn, 0,2 мМ + Mg, 2,0 мМ.

Примечание: условия опыта см. табл. 6. Здесь восстановитель – ДТТ;
концентрацию магния варьировали.
В 200 мкл реакционной смеси – 120 мкл препарата фермента (60 мкг).


Представленные результаты, в их совокупности, свидетельствуют о
функционировании в клетках P. freudenreichii, практически не синтезирующей
кобаламин, альтернативной (независимой от него) РНРазы, представляющей собой
металлосодержащий (по данным ингибиторного анализа с ГМ), зависимый от Mn и
38
О2 гетеродимерный фермент. Принимая во внимание биологическую роль РНРазы,
заключили, что это и является основной причиной продолжающегося синтеза ДНК
при дефиците корриноидов. Присутствие в клетках одного и того же организма двух
и более типов РНРаз было подтверждено на примерах E. coli (Fontecave et al., 1989;
Reichard, 1993), Pseudomonas spp. (Jordan et al., 1999) и других бактерий (Masalha et
al., 2001; Borovok et al., 2002).
5. Регуляция кобаламином системы рибонуклеотидредуктазы P.
freudenreichii. Потенциальная способность бактерии, которая исходно практически
не синтезирует корриноиды (вариант Cor=) и развивается на обогащённой среде, к
биосинтезу и использованию в метаболизме корриноидов в больших количествах
сохраняется. Она реализуется в присутствии соли кобальта (1 – 3 мг.л-1) за период
(12 -16 часов), что не превышает времени удвоения массы клеток. Вероятно, под
действием кобальта, вызывающего биосинтез корриноидов в клетках, происходит
обратная перестройка метаболизма бактерии на уровне экспрессии генов.
В клетках бактерии, практически не содержащих Cbl (вариант Cor=), отсутствует
активность AdoCbl-зависимой РНРазы, использующей восстановленный глутатион
в бесклеточной системе. Введение AdoCbl в растущую (на обогащенной триптоном
среде) культуру приводило к появлению в клетках (за период, примерно в 4 раза
меньший времени удвоения биомассы) активности AdoСbl-зависимой РНРазы со
всеми, присущими ей функциональными свойствами. Хлорамфеникол
препятствовал этому (рис. 12), что указывает на её формирование под действием
AdoCbl на уровне биосинтеза белка.
Таким образом, Cbl выступает в роли регулятора (фактора перестройки)
системы рибонуклеотидредуктаз. Он оказывает регуляторное воздействие и на
активность альтернативных ферментов (посттрансляционная регуляция).
Возможные состояния альтернативных РНРаз в клетках P. freudenreichii обсуждены
в диссертации.
6. Практически значимые аспекты работы. Среди классических (молочных)
ПКБ P. freudenreichii наиболее значима. Две главные области её применения –
производство витамина В12 и производство сыров «твёрдых» сортов.
Рекомендовано (Ryzhkova, 2001) при создании рекомбинантных штаммов P.
freudenreichii культивировать бактерию, добиваясь высокого уровня образования
39



120


Активность AdoCbl-РНРазы, нмоль, мг-1. ч-1
100



80



60 -



40



20 -
хлорамфеникол,
100 мкг.мл-1

0
А Б

Рис. 12. Появление активности AdoCbl-зависимой рибонуклеотидредуктазы
в Cor= клетках под действием аденозилкобаламина

Cor = (содержание корриноидов < 2 мкг.г-1 АСБ)
Обозначения:

Cor = + AdoCbl, 10 мкМ (введён in vitro)

Cor = + AdoCbl (введён in vivo; A - 0,3; Б - 3,0 мг. л-1)

Примечание: AdoCbl или AdoCbl + хлорамфеникол добавлены в 68 ч культуру. Анализ
проведён через 5 ч продолжающегося культивирования. Условия реакции см. в табл. 3.
Здесь в качестве восстановителя использован восстановленный глутатион.



корриноидов или дополняя культуру кобаламином, что обусловливает эффективный
синтез и высокое содержание ДНК в клетках P. freudenreichii Впервые была
предложена (совместная работа с сотрудниками ГНИИ Хлебопекарной
промышленности РАСХН) для применения в хлебопечении в составе закваски для
теста с целью улучшения органолептических свойств хлеба, обогащения его
40
биологически активными веществами и защиты от «картофельной болезни»
(авторские свидетельства на изобретения: № 1439766, приоритет от 5 января 1987 г.
и № 1608849, приоритет от 29 сентября 1988 г.). В современных пищевых и
сельскохозяйственных биотехнологиях актуально и перспективно применение в
качестве антисептика пропионовой кислоты микробного происхождения. Основным
действующим началом является анион кислоты (Glatz, 1992).




Микрофотография поверхности гранулы геля, в порах
Рис. 13.
которого локализованы иммобилизованные клетки
P. freudenreichii
Сканирующий электронный микроскоп. Увеличение 12000х.


Препятствиями для повышения выхода пропионата в любом из способов,
основанных на периодическом культивировании ПКБ, являлось ингибирование
ферментации конечными продуктами (пропионовой и уксусной кислотами) и
неэкономичность выделения кислот из разбавленных растворов. Предложенное
нами изобретение (авторское свидетельство, № 652214, приоритет от 2 августа 1977
г.) отличалось принципиальной новизной и повышенной эффективностью: впервые
применили биокатализатор на основе иммобилизованных клеток (ИК) P.
freudenreichii, что было одним из первых примеров многостадийного
(полиферментного) процесса, осуществляемого бактериальными клетками в
41
иммобилизованном состоянии (рис. 13) в протоке или в реакторе с заменой
раствора. Впервые была применена периодическая экспозиция ИК в питательной
среде для стабилизации работы биокатализатора во времени (Иордан и др., 1979).
ИК ПКБ были предложены для получения свободных нуклеотидов (Иконников и
др., 1982), улучшающих вкусовые свойства пищевых продуктов, которые активно
выделяются голодающими клетками бактерий. Разработан способ получения
индивидуальных 2,-дезоксирибонуклеозид-5,-дифосфатов путём одностадийной
трансформации соответствующих рибонуклеотидов. Биокатализатор представляет
собой AdoCbl-зависимую РНРазу, которая локализована в пермеабилизованных
(тритоном Х-100) клетках P. freudenreichii и функционирует в соответствующей
реакционной смеси (патент РФ, № 2077589, приоритет от 9 апреля 1993 г.).


Заключение
В результате проведённой работы сформировалось новое представление о роли
кобальта и корриноидов в жизнедеятельности P. freudenreichii, представляющей
научный интерес (прежде всего как организм, образующий в норме большие
количества эндогенных корриноидов) и имеющей практическое значение.
Кобальт – редкий элемент, встречающийся в земной коре примерно в 1000 раз
реже, чем железо. В живой природе кобальт действует преимущественно как
центральный атом комплексных соединений группы витамина В12 (корриноидов),
древнейших полифункциональных биокатализаторов и метаболитов. Мы
установили, что ионы кобальта существенны для развития P. freudenreichii; причём
концентрационная зависимость роста микроорганизма прослежена впервые.
Показано, что физиологические функции ионов кобальта реализуются через
корриноиды, которые в определённых, «жестких» условиях существования
необходимы бактерии в больших количествах. Прокариоты с повышенной
потребностью в ионах кобальта известны; они являются анаэробами или
микроаэрофилами. (Kliewer, Evans, 1963; Cowles et al., 1969; Fogg et al., 1973; Beck,
1982; Kumar et al., 1987; Florencio et al., 1994). Способность P. freudenreichii к
интенсивному образованию соединений группы витамина В12 не является
уникальной; значительно более продуктивны по кобамидам (гомо)ацетогенные
бактерии и археи-метаногены. В силу множественности метаболических функций
42
корриноидов у прокариот (Рыжкова, 2003) невозможно, видимо, дать универсальное
объяснение этому, однако настоящая работа на примере пропионовокислой
бактерии акцентирует внимание на значении некоферментных функций витамина
В12 в активном (первичном) метаболизме.
Научные предпосылки и полученные экспериментальные данные позволили
впервые рассматривать корриноиды как факторы, способствующие
аэротолерантности P. freudenreichii и требующиеся для этой функции в высоких
внутриклеточных концентрациях.. Высокому естественному уровню образования
корриноидов сопутствует также устойчивость бактерии к летальному действию
ультрафиолетового излучения, что в целом отражает эффективность метаболизма P.
freudenreichii, активно синтезирующей кобамиды. Вместе с тем известные ранее
кобамидные ферменты P. freudenreichii сохраняют свою активность при снижении
уровня корриноидов в клетках на порядок (метионинсинтазная реакции) или на два
порядка (изомеризация сукцинил-КоА в метилмалонил-КоА – ключевая реакция
ПКБ). В метаболизме P. freudenreichii нами открыты две неизвестные ранее
биохимические реакции, протекающие при участии кобамидов. Впервые показано
трансметилирование ДНК, зависимое от MeCbl как донора метильных групп (Iordan
et al., 1979; Антошкина и др., 1979), что подтверждено позже на препаратах из
клеток животных (Phohl-Leszkowicz et al., 1991). Обнаружено требующее AdoCbl
превращение рибонуклеотида в дезоксирибонуклеотид (Иордан и др., 1975; Иордан,
Петухова, 1989) – реакция, описанная ранее для L. leichmanii, R. meliloti и Euglena
gracilis (Blakley, Barker, 1964; Blakley et al., 1965; Cowles, Evans, 1968; Hamilton,
Blakley, 1969). Изучение свойств AdoCbl-зависимой РНРазы P. freudenreichii
показало, что AdoCbl действует как кофермент, но при этом регулирует активность
фермента.
Впервые установлено, что кобаламин может быть прямо и специфически
вовлечён в процесс образования ДНК у прокариот (Иордан и др., 1987; Иордан,
1992; Иордан, Прянишникова, 1994). Представлены экспериментальные данные и
предложено объяснение необходимости высокого содержания корриноидов в
клетках P. freudenreichii для эффективного образования ДНК. Основной «мишенью»
служит AdoCbl-зависимая РНРаза, которая имеет слабую связь с AdoCbl и, видимо,
подобно другой AdoCbl-зависимой элиминазе (диолдегидратазе) нуждается в пуле
43
AdoCbl в клетках для реконструкции холофермента. Активные центры этих
ферментов имеют тенденцию к самоинактивированию в процессе катализа (Mori et
al., 1997; Licht et al., 1996; Stubbe et al., 1998; 2001). Нами показано, что фермент
даже в норме (при высоком уровне образования корриноидов) метаболически
лимитирован по кобаламину, вероятно, вследствие особенностей регуляции
биосинтеза корриноидов у бактерии (Быховский, 1979; Bykhovsky et al., 1997).
Вместе с тем мы пришли к заключению, что метаболизм бактерии не «настроен»
исключительно на высокий уровень образования кобамидов, ибо P. freudenreichii
способна активно развиваться при их 100- и 1000-кратном дефиците в клетках, но
при этом изменяются её ростовые потребности и другие физиологические свойства.
Впервые было показано, что в клетках одного организма могут
функционировать рибонуклеотидредуктазы разных типов [Иордан и др., 1975;
Иордан и др., 1986; Иордан, Петухова, 1989; Iordan, 1995; Iordan, Petukhova, 1995;
Иордан и др., 2000; Ryzhkova (Iordan), 2001], поэтому тип РНРазы, определяемый
природой кофермента и строением активного центра, не может быть использован в
качестве филогенетического признака, как полагали ранее (Auling, Follmann, 1994).
В результате идентификации генов двух и даже трёх типов РНРаз в геноме
одного и того же микроорганизма ранее установленный нами факт был подтвержден
другими исследователями (Jordan et al., 1999; Masalha et al., 2001; Borovok et al.,
2002), но первое подтверждение появилось в конце 80-х годов, когда обнаружили
вторую («анаэробную») РНРазу у E. coli (Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989).
Исходя из известной критической роли РНРазы в анаболизме ДНК
функционированием альтернативной РНРазы, зависимой от марганца и
молекулярного кислорода, мы объяснили способность P. freudenreichii
осуществлять биосинтез ДНК и развиваться практически в отсутствие кобаламина в
клетках (Иордан и др., 2000). По нашим предварительным данным у бактерии,
практически не синтезирующей кобаламин, функционируют и другие ферменты,
альтернативные кобамидcодежащим, например, независимая от Cbl
метионинсинтаза, обеспечивающая тимидилатсинтазную реакцию свободным ТГФ,
и метилтрансфераза, катализирующая метилирование ДНК от S-AdoMet как
субстрата.
44
Обусловленные ионами кобальта (кобаламином) обратимые физиологические
состояния бактерии, перестройка системы РНРаз, изменения характера
пропионовокислого брожения и анаболизма ДНК позволяют рассматривать витамин
В12 как фактор, определяющий пластичность обмена веществ (адаптивность) P.
freudenreichii.
Некоторые из особенностей физиологии (метаболизма) бактерии, выявленные в
настоящей работе, имеют практическое значение, например, физиологический
контроль интенсивности репликации и содержания ДНК в клетках бактерии с
помощью кобаламина или возможность поддержания заданного содержания
(витамина В12) в пищевом продукте. Предложены изобретения, в которых
препараты клеток и ферментов P. freudenreichii представляют собой оригинальные
биокатализаторы для получения практически значимых метаболитов.


Выводы

1). Впервые наблюдали, что P. freudenreichii использует ионы кобальта для развития
и выживания в «жёстких» условиях, а именно при воздействии стрессорных
факторов среды. Высокое содержание внутриклеточных корриноидов, уровень
образования которых определяет концентрация ионов кобальта в среде,
существенно для поддержания аэротолерантности бактерии и её устойчивости к
летальному действию ультрафиолетовой радиации.
2). В метаболизме P. freudenreichii обнаружили две биохимические реакции,
протекающие при участии кобаламина: трансметилирование ДНК (от
метилкобаламина как донора метильных групп) и превращение рибонуклеотидов в
дезоксирибонуклеотиды. Эти реакции происходят в полноценных по содержанию
корриноидов клетках бактерии. Основной энергетический процесс –
пропионовокислое брожение, сохраняет свою интенсивность при 100-кратном
дефиците корриноидов в клетках; для нормального биосинтеза метионина
достаточно десятой доли суммарных корриноидов.
3). На примере P. freudenreichii впервые показано, что прокариотический организм
может синтезировать ДНК альтернативно: с участием и без участия кобаламина.
Наиболее эффективно образование ДНК происходит в полноценных по содержанию
45
витамина В12 клетках. При его дефиците ионы марганца и кислород стимулируют
процесс, а экзогенный кобаламин действует как ингибитор.
4). Выяснили, что первой и основной «мишенью» положительного воздействия
кобаламина на биосинтез ДНК является зависимая от аденозилкобаламина
рибонуклеотидредуктаза, которая в норме (при высоком уровне образования
корриноидов) метаболически лимитирована по кобаламину.
5). Впервые показали функционирование двух типов рибонуклеотидредуктаз у
одного организма: зависимой и независимой от аденозилкобаламина. Независимый
от кобаламина фермент обеспечивает биосинтез ДНК P. freudenreichii при дефиците
корриноидов в клетках.
6). Констатировали, что P. freudenreichii способна активно развиваться без
добавления в среду ионов кобальта, когда уровень образования витамина В12 снижен
(по сравнению с исходным, физиологически значимым) на два порядка и более, при
этом она испытывает новые ростовые потребности и перестраивает метаболизм.
Перестройка носит обратимый характер.
7). Результаты, полученные в работе, реализованы в предложенных способах
получения пропионатов и дезоксирибонуклеотидов, а также внедрены в
хлебопекарной промышленности в виде новой закваски для приготовления теста (на
основе P. freudenreichii), улучшающей качество хлеба.


СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ и ИЗОБРЕТЕНИЙ

Обзорные статьи:
Иордан Е.П. Рибонуклеотидредуктаза микроорганизмов и участие витамина
1.
В12 в образовании дезоксирибонуклеотидов. Усп. микробиол. 1982. № 17. С. 29-41.
Иордан Е.П. Витамин В12 в синтезе ДНК у микроорганизмов. Усп. совр.биол.
2.
1990. Т. 110. № 1(4). С. 79-90.
Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии
3.
прокариотических организмов. Прикл. биох. и микробиол. 2003. Т.39. № 2. C. 133-
159.
Экспериментальные работы:
Машур В.А., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Брожение, вызываемое мутантом
4.
пропионовокислых бактерий, не образующих кофермент В12. Прикл. биох. и
микробиол. 1971. Т. 7. № 5. С. 552-555.
Машур В.А., Иордан Е.П. О роли витамина В12 в обмене веществ
5.
пропионовокислых бактерий. Вестник Московского университета. (Биология,
Почвоведение). 1972. № 2. С. 107-109.
46
Воробьева Л.И., Иордан Е.П. Роль витамина В12 в обмене веществ
6.
пропионовокислых бактерий. Научн. докл. высш. шк. Биол. науки. 1973. № 7. С. 94-
99.
Иордан Е.П., Воробьева Л.И., Гайтан В.И. О влиянии витамина В12 на уровень
7.
сульфгидрильных групп и активность некоторых дегидрогеназ в клетках
Propionibacterium shermanii. Микробиология. 1974. Т. 43. № 4. С. 596-599.
Иордан Е.П., Воробьева Л.И., Гайтан В.И. Рибонуклеотидредуктаза
8.
Propionibacterium shermanii. Микробиология. 1975. Т. 44. № 4. С. 609-614.
Иордан Е.П., Антошкина Н.В. О роли витамина В12 в обмене веществ
9.
пропионовокислых бактерий. Труды 1-й Республиканской конференции молодых
ученых. 1976. Ташкент: Узб. АН, 1976.
Иордан Е.П. О роли витамина В12 в обмене веществ Propionibacterium
10.
shermanii. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук. М.: МГУ, 1976.
Воробьева Л.И., Иордан Е.П. Функции кобамидных коферментов в
11.
метаболизме пропионовокислых бактерий (обзорная статья). Респ. межведомств. сб.
«Витамины». Киев: Наукова Думка, АН УССР, 1976. № 9. С. 16-20.
Воробьева Л.И., Иордан Е.П., Гайтан В.И. Способ получения пропионовой
12.
кислоты. Авторское свидетельство №652214 от 21 ноября 1978 г. Приоритет от 2
августа 1977 г.
Антошкина Н.В., Иордан Е.П. О возможной роли корриноидов в
13.
метилировании ДНК пропионовокислых бактерий. Труды 7-й Республиканской
конференции молодых ученых. 1977. Рига: АН Латв. ССР, 1977.
Антошкина Н.В., Иордан Е.П. Об участии метилкобаламина в метилировании
14.
ДНК пропионовокислой бактерии. Труды 2-й Республиканской конференции
молодых ученых. 1978. Ташкент: АН Уз.ССР, 1978.
Антошкина Н.В., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Определение активности
15.
рибонуклеотидредуктазы методом тонкослойной хроматографии на ЭКТЕОЛА-
целлюлозе. Прикл. биох. и микробиол. 1978. Т. 14. № 2. С. 295-299.
Антошкина Н.В., Воробьева Л.И., Иордан Е.П. Участие метилкобаламина в
16.
метилировании ДНК Propionibacterium shermanii. Микробиология. 1979. Т.48. № 2.
С. 217-220.
Jordan E.P., Antoshkina N.V., Vorobjeva L.I. The participation of coenzyme B12 in
17.
the synthesis of DNA by Propionibacterium shermanii. Proceedings of the Third
European Symposium on Vitamin B12 and Intrinsic factor. 1979. Zurich (Switzerland). In:
"Vitamin B12", B. Zagalak and W. Friedrich (eds). Berlin – N.Y.: Walter de Gruyter and
Co., 1979. P. 1095-1099.
Jordan E.P., Antoshkina N.V., Vorobjeva L.I. The participation of coenzyme B12 in
18.
the synthesis of DNA by Propionibacterium shermanii. Abstracts. The Program of Third
European Symposium on Vitamin B12 and Intrinsic factor. 1979. Zurich: Chemische
Rundschau. 1979. № 9. S.3.
Иордан Е.П., Иконников Н.П., Коврижных В.А., Воробьева Л.И. Образование
19.
органических кислот иммобилизованными пропионовокислыми бактериями в
проточной системе и возможность стабилизации процесса. Прикл. биохим. и
микробиол. 1979. Т. 15. № 4. С. 515-521.
Иордан Е.П., Воробьева Л.И. О локализации витамин В12-зависимой
20.
рибонуклеотидредуктазы в клетках Propionibacterium shermanii. Микробиология.
1981. Т. 50. № 4. С. 736-738.
47
Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Выделение нуклеотидов и их
21.
производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii. Прикл.
биох. и микробиол. 1982. Т. 18. № 1. С. 34-40.
Jordan E.P., Vorobjeva L.I. Vitamin B12 as a regulatory factor in some anabolic
22.
reactions in the propionic acid bacteria. Abstracts. FEMS International Symposium
"Environmental regulation of microbial metabolism". 1983. Puschino (USSR). Пущино:
ОНТИ НЦБИ, 1983.
Иордан Е.П., Новожилова Т.Ю., Воробьева Л.И. Синтез ДНК в связи с
23.
различным содержанием витамина В12 в клетках Propionibacterium shermanii.
Микробиология. 1983. Т. 52. № 4. С. 591-596.
Иордан Е.П., Новожилова Т.Ю., Воробьева Л.И. Влияние уровня образования
24.
витамина В12 в клетках на рост и некоторые стороны конструктивного метаболизма
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Прикл. биох. и микробиол. 1984. Т.
20. № 6. С. 765-772.
Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Новые данные о роли корриноидов в
25.
анаболических реакциях пропионовокислых бактерий. Труды 7-го Съезда Всесоюзн.
микробиол. общества. 1985. Алма-ата: АН Казах. ССР, 1985.
Vorobjeva L.I., Jordan (Iordan) E.P., Petukhova N.I. Regulation of DNA synthesis
26.
and of B12-dependent ribonucleotide reductase in propionic acid bacteria. Proceedings of
the Sixth International Symposium on Actinomycetes Biology. Debrecen (Hungary),
1985. P. 429.
Vorobjeva L.I., Jordan (Iordan) E.P. Vitamin B12 in the integration of the metabolic
27.
functions of the propionic acid bacteria. Proceedings of the 14-th International Congress of
Microbiology. September 7-13, 1986. Manchester (G.B.). Manchester: International Union
of Microbiological Societies, 1986.
Иордан Е.П., Петухова Н.И., Воробьева Л.И. Регуляторное воздействие
28.
витамина В12 на рибонуклеотидредуктазную систему пропионовокислых бактерий.
Микробиология. 1986. Т. 55. № 4. С. 533-538.
Петухова Н.И., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии как
29.
источник рибонуклеотидредуктазы, активируемой витамином В12. Труды 3-й
Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". 1986.
Кобулети. Пущино: ОНТИ, НЦБИ, 1986. С. 169.
Иордан Е.П., Петухова Н.И., Воробьева Л.И. Влияние производных
30.
кобаламина на синтез ДНК в клетках Propionubacterium freudenreichii subsp.
shermanii. Научн. докл. высш. шк. Биол. науки. 1987. № 1. С. 5-10.
Воробьева Л.И., Наумова Е.С., Бурдыгина Г.И., Иордан Е.П., Симоновская
31.
Л.С. Антисептическая защита фильмовых материалов при хранении. Биотехнология.
1987. № 5. С. 74-76.
Воробьева Л.И., Наумова Е.С., Иордан Е.П., Бурдыгина Г.И.
32.
Микроорганизмы, вызывающие коррозию фильмовых материалов. Биотехнология.
1988. № 4. C. 73-76.
Богатырёва Т.Г., Иордан Е.П., Сафронова Л.В., Воробьёва Л.И. Поландова
33.
Р.Д., Быстрова А.И., Ольсинская Н.Л. Способ производства хлеба. Авт. свид. №
1439766 от 22 июля 1988 г. ДСП. Приоритет от 5 января 1987 г.
Богатырева Т.Г., Иордан Е.П. Инструкция по применению пропионовокислой
34.
закваски. Для предприятий хлебопекарной отрасли. М., 1988. С. 1-5.
48
Иордан Е.П., Петухова Н.И. Перестройка рибонуклеотидредуктазной системы
35.
пропионовокислых бактерий при подавлении образования витамина В12.
Микробиология. 1989. Т. 58. № С. 533-538.
Иордан Е.П., Овчинников Л.Ю. Витамин В12 лимитирует синтез ДНК у
36.
пропионовокислых бактерий. Труды Всесоюзной конференции «Лимитирование и
ингибирование роста микроорганизмов. 1989. Пущино: ОНТИ, НЦБИ, 1989, С. 39.
Иордан Е.П., Бриллиантова Р.О., Колмакова Н.Г., Овчинников Л.Ю.,
37.
Петухова Н.И. Зависимость синтеза ДНК от витамина В12 у бактерий рода
Propionibacterium. Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология. 1990. №
4. С. 47-52.
Богатырёва Т.Г., Иордан Е.П., Быстрова А.И., Воробьёва Л.И., Поландова
38.
Р.Д., Дик Э.С., Нефёдова В.М. Способ предотвращения заболевания хлеба
картофельной болезнью. Авт. свид. № 1608849 от 22 июня 1990 г. Приор. от 29
сентября 1988 г.
Vorobjeva L.I., Iordan E.P., Petukhova N.I. New functions of vitamin B12.
39.
Proceedings of the First International Congress on Vitamins and Biofactors in Life
Science. ICVB Symposium: Vitamin B12 challenges for the future. 1991. Kobe (Japan):
International Conference Center, 1991. 2P-72.
Иордан Е.П. Модуляция в образовании ДНК Propionibacterium freudenreichii
40.
subsp. shermanii при лимитировании по корриноидам. Микробиология. 1992. Т. 61.
№ 3. С. 341-346.
Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Способ получения
41.
дезоксирибонуклеотидов. Патент № 2077589 РФ. Зарегистрирован 20 апреля 1997 г.
Приоритет изобретения 9 апреля 1993 г.
Богатырева Т.Г., Прянишникова Н.И, Иордан Е.П. Исследование
42.
протеолитической активности молочнокислых, пропионовокислых бактерий и
дрожжей, применяемых в хлебопечении. Биотехнология и управление. 1994. № 1(4).
С. 40-43.
Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Интенсификация синтеза ДНК в клетках
43.
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii под действием 5,6-
диметилбензимидазола. Прикл. биох. и микробиол. 1994. Т. 30. № 1. С. 137-142.
Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Превращение рибонуклеотида в 2,-
44.
дезоксирибонуклеотид пермеабилизованными клетками пропионовокислых
бактерий. Прикл. биох. и микробиол. 1994. Т. 30. № 3. С. 396-402.
Iordan E.P. Different hydrogen donors in alternative ribonucleotide reductase
45.
systems of Propionibacterium freudenreichii. Proceedings of the 4-th International
Conference "Thioredoxins and related proteins". 1995. Whitzenhausen–Kassel (Germany):
Univ. Kassel, 1995. P. 42.
Iordan E.P., Petukhova N.I. Presence of oxygen-consuming ribonucleotide
46.
reductase in corrinoid-deficient Propionibacterium freudenreihii. Arch. Microbiol. 1995.
V. 164. P. 377-381.
Прянишникова Н.И., Иордан Е.П. Зависимый от витамина В12 синтез ДНК у
47.
стрептомицетов. Микробиология. 1998. Т. 67. № 1. С. 26-29.
Иордан Е.П., Брюханов А.Л., Дунаевский Я.Е., Прянишникова Н.И., Данилова
48.
И.В. Зависимая от марганца рибонуклеотидредуктаза Propionibacterium
freudenreichii subsp. shermanii: частичная очистка, характеристика и роль в
биосинтезе ДНК. Микробиология. 2000. Т. 69. № 4. С. 471-477.
49
Iordan E.P., Danilova I.V. Ribonucleotide reductases of Propionibacterium
49.
freudenreichii and of some streptomycetes. Proceedings of the 5-th International
Conference "Thioredoxins and related proteins". 2000. Smolenice – Bratislava (Slovak
Republic): Univ. Bratislava, 2000. P. 36.
Ryzhkova (Iordan) E.P. Alternative of physiological and metabolic states of the
50.
strain Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii (VKM-103) in connection with
corrinoid formation. Proceedings of the 3-rd International Symposium on
Propionibacteria. 2001. Zurich: Swiss Federal Institute of Technology Zurich (ETH),
2001. P. 14.
Данилова И.В. Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Нетрусов А.И., Рыжкова (Иордан)
51.
Е.П. Участие витамина В12 в биосинтезе ДНК Methylobacterium dichloromethanicum,
зависимое от интенсивности аэрации. Микробиология. 2003 (в печати).

Список сокращений
АСБ = абсолютно сухая биомасса
БЛ = блеомицин
ВФ = «внутренний фактор» (IF, intrinsic factor)
ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография
5,6-ДМБ = 5,6-диметилбензимидазол
ДТТ = дитиотреитол
ДФА = дифениламин
Гл-SH = восстановленный глутатион
ГМ = гидроксимочевина
ИК = иммобилизованные клетки
МСаза = метионинсинтаза
МТР = метилтрансфераза
НК = нуклеиновые кислоты
ПБ = пропионовокислое брожение
ПК = пропионовая кислота
ПКБ = пропионовокислые бактерии
ПХМБ = парахлормеркурийбензоат
РНРаза = рибонуклеотидредуктаза
СОД = супероксиддисмутаза
ТГФ = тетрагидрофолиевая кислота (тетрагидрофолат)
УФ = ультрафиолетовое излучение
Фактор В = кобинамид (кобамид без ?-лиганда атома кобальта)
ФАОЗ = ферменты, участвующие в антиокислитльной защите клетки
ЦПМ = цитоплазматическая мембрана
ЭПР = электронный парамагнитный резонанс
ЭТЦ = электрон-транспортная цепь
AdoCba = аденозилкобамид
AdoCbl = аденозилкобаламин
Cba = кобамиды (амидированные корриноиды, соединения группы витамина В12)
Cbi = кобинамид, фактор В
Сbl = кобаламин (кобамид с основанием 5,6-ДМБ, истинный витамин В12)
СN-Cbl = цианокобаламин
Grx = глутаредоксин
MeCbl = метилкобаламин
м6A = 6-метиладенин
м5C = 5-метилцитозин
MeТГФ = N5-метилтетрагидрофолат
Trx = тиоредоксин
S-AdoMet = S-аденозилметионин
*******
Подписано в печать 06.10.2003 г.
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия»,
Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус.
e-mail: zakaz@stprint.ru, тел. 9393338
Автореферат содержит примерно 2 печатных листа.
Заказ № 399, тираж 65 экз.

<<

стр. 2
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ