СОДЕРЖАНИЕ




На правах рукописи







ЗАЙНАГЕТДИНОВ Ринат Закуанович



РОЛЬ КОМПОНЕНТОВ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА
В РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАКА ПЕЧЕНИ




03.00.04 - биохимия
14.00.16 - патологическая физиология



Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук











Новосибирск 2006


Работа выполнена в ГОУ ВПО "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"
(г. Томск)



Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Серебров Владимир Юрьевич

кандидат медицинских наук Новицкий Сергей Викторович


Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Меньшикова Елена Брониславовна

кандидат биологических наук Суменкова Дина Валерьевна


Ведущая организация:
ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН


Защита состоится "___" ___________2006 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.34.01 в НИИ биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2;
тел.: 8-3832-33-54-81


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН


Автореферат разослан " " 2006 г.




Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук Русских Галина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В настоящее время смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире, уступая лишь патологии сердечно-сосудистой системы. В связи с этим изучение внутриклеточных механизмов развития злокачественных новообразований, а так же поиск эффективных способов их лечения, является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины.
Важную роль в развитии процессов малигнизации отводят липидам [Галицкий В.А., 2003; Дятловицкая Э.В., 1995; Стручков В.А., 2000]. Липиды, как известно, являются основными структурными компонентами клеточных мембран, служат формой запасания и транспорта энергетического "топлива" [Бергельсон Л.Д., 1982; Болдырев.А.А. 1986]. Кроме того, в качестве вторичных посредников липиды могут передавать внутрь клетки различные внешние сигналы, а также являются важнейшей системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов [Безуглов В.В., 1998].
Особый интерес представляет изучение роли сфингомиелинового цикла в процессах гепатоканцерогенеза. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза (сфингозин, сфингозин-1-фосфат, церамиды) в качестве вторичных посредников играют определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы - иммунный ответ, рост, дифференцировку, пролиферацию и апоптоз [Алесенко А.В. и др., 1999; Дятловицкая Э.В. и др., 1998; Hannun Y.A.. 1996; Nilsson A., 2006; Taha T., 2004]. Апоптоз является одним из механизмов защиты, выработанных макро организмом в процессе эволюции против злокачественно трансформированных клеток. Нужно отметить, что апоптотическая гибель в норме должна запускаться в любой клетке, подвергающейся опухолевому перерождению. Однако, благодаря многочисленным повреждениям механизмов самого процесса запрограммированной элиминации злокачественно трансформированных клеток, регуляторные стимулы, приводящие нормальную клетку к гибели, могут оказаться неэффективными. При этом, напротив, в клетках происходит увеличение пролиферативной активности [Алесенко А.В. и др., 1998].
Функциональное состояние липидов мембран зависит от интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и фосфолиполиза, которые в раковых клетках, в период формирования опухоли, протекают более интенсивно [Don C. et al., 2000; Jayadev S. et al., 1994]. Более того, окисленные липиды легче подвергаются гидролизу фосфолипазами, а фосфолипазы, в свою очередь, нарушая целостность липидного слоя мембран, делают липиды более доступными для процессов свободнорадикального окисления [Дудник Л.Б. и др., 2000]. Это является дополнительным фактором повреждения для перерожденных клеток. Данные процессы активно участвуют в проявлении дополнительных мутаций в уже поврежденном геноме, что способствует их прогрессии, а так же меняет метаболизм окружающих опухоль тканей.
В связи с вышесказанным, многообразие функций сфингомиелина и его производных, связанных с важнейшими клеточными событиями в норме и при патологии, определяет необходимость изучения изменений содержания компонентов сфингомиелинового цикла в ткани печени, как в динамике развития гепатоцеллюлярного рака, так и в ситуации попыток регуляции сфингомиелинового цикла.
Цель работы - изучить роль основных компонентов сфингомиелинового цикла в развитии экспериментального гепатоцеллюлярного рака.
Задачи исследования:
1. Определить содержание компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелина, церамида и сфингозина) в печени крыс в норме и при развитии экспериментальной гепатоцеллюлярной карциномы, а также после курсового введения на фоне гепатоканцерогенеза липосом, содержащих сфингомиелин или церамид.
2. Оценить содержание ТБК-активных продуктов и активность каталазы в печени в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы у крыс, а также при введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне развития рака печени.
3. Исследовать активность фосфолипазы А2 и фосфолипазы D в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы и после введения в процессе развития рака печени липосом, содержащих сфингомиелин или церамид.
4. С помощью морфологических методов оценить динамику развития экспериментальной гепатоцеллюлярной карциномы при введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Развитие экспериментального гепатоцеллюлярного рака у крыс проявляется в повышении содержания сфингомиелина и уменьшении количества церамидов. Повышенное содержание сфингозина в раннем периоде гепатоканцерогенеза сменяется снижением его уровня к моменту формирования рака печени.
2. Изменения содержания компонентов сфингомиелинового цикла в печени у крыс на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы реализуются при активации фосфолипаз А2 и D, а также сопровождаются повышением уровня ТБК-активных продуктов и активности каталазы.
3. Курсовое введение на фоне гепатоканцерогенеза липосом, нагруженных сфингомиелином или церамидом, приводит к повышению содержания этих компонентов в печени при снижении уровня сфингозина, что сопровождается снижением активности фосфолипаз А2 и D, каталазы и содержания ТБК-активных продуктов.
4. Церамид, введенный в составе липосом на фоне развития гепатоцеллюлярного рака, способствует более выраженному, по сравнению с введением сфингомиелина, повышению содержания церамида в печени, что сопровождается снижением содержания ТБК-активных продуктов, активности каталазы, фосфолипаз А2 и D, интенсивности хронического воспалительного процесса, являющегося фактором формирования гепатоцеллюлярного рака.
Научная новизна. Получены новые данные, касающиеся выяснения роли биоактивных липидов - компонентов сфингомиелинового цикла - в процессах гепатоканцерогенеза. Показано, что при развитии экспериментального рака печени снижение содержания церамида, сфингозина в гепатоцитах сопровождается повышением содержания сфингомиелина, ТБК - активных продуктов, активности каталазы, фосфолипаз А2 и D.
Впервые в эксперименте in vivo на крысах предпринята попытка воздействия на интенсивность процесса канцерогенеза, индуцированного N-диэтилнитрозамином, путем курсового введения компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелина или церамида) в составе липосом.
Установлено, что церамид, введенный в составе липосом, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака вызывает выраженное (по сравнению с введением сфингомиелина) повышение его содержания, приводит к снижению уровня ТБК-активных продуктов, активности фосфолипаз А2 и D в печени, что способствует, по данным морфологического исследования, снижению интенсивности хронического воспалительного процесса, являющегося одним из факторов формирования гепатоцеллюлярного рака.
Практическая значимость работы. Настоящая работа вносит вклад в развитие представлений о патогенезе гепатоцеллюлярного рака. Результаты исследований свидетельствуют о важной роли основных компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелин и церамид) в регуляции процессов развития гепатоцеллюлярной карциномы, что является предметом проведения дальнейших исследований в области создания новых фармакологических средств.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены и обсуждены на научных семинарах кафедры биохимии и молекулярной биологии, региональных, российских и международных конференциях: 7th Korea - Russia International Symposium on Science and Technology (June 26 - July 6, 2003, Ulsan, Republic of Korea); 8th International conference "Eicosanoids and Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation and Related Diseases" (September 7-10, 2003, Chicago, USA); конференции посвященной 25-летию факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов (Томск, 2004); 8th Korea - Russia International Symposium on Science and Technology (June 26 - July 6, 2004, Tomsk, Russia); Международной юбилейной конференции "Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии" (Томск, 2004); FEBS WORKSHOP № 05-28W on Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders (June 21 - 24, 2005, Dijon, France); V - Сибирском Физиологическом съезде (Томск, 2005); Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень, 2005); 9th International conference "Eicosanoids and Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation and Related Diseases" (September 10-14, 2005, San - Francisco, USA).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 10 рисунков и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты исследования", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список литературы". Библиография включает 173 литературных источников, в том числе 94 отечественных и 79 иностранных.
Автор выражает искреннюю признательность заведующему кафедрой патологической анатомии СибГМУ д.м.н, профессору Перельмутеру В.М., а также к.м.н., доценту Пурлику И.Л. за помощь в проведении морфологического исследования ткани печени крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились в осеннее - зимний период на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 100-150 г Животные содержались в условиях вивария на стандартном водно-пищевом рационе и были поделены на следующие группы: I-контрольная группа (интактные животные); II - опыт 1 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой); III - опыт 2 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а также проводили инъекции не нагруженных ("пустых") липосом); IV - опыт 3 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а так же проводили инъекции липосом, нагруженных церамидом); V - опыт 4 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а также проводили инъекции липосом, нагруженных сфингомиелином). Эвтаназию производили, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденные Министерством Здравоохранения России, путем дислокации шейного отдела позвоночника под эфирным наркозом. Для моделирования гепатоцеллюлярного рака животные вместо питьевой воды получали водный раствор 0,02% N-диэтилнитрозамина (N-ДЭНА). Материалом исследования служила печень крыс. Животным в опытных группах в хвостовую вену вводили по 0,25 мл на 100 г массы тела эмульсии, содержащей липосомы. Использовали липосомы, нагруженные сфингомиелином или церамидом ("Sigma Aldrich", США), либо не нагруженные ("пустые"). При каждой инъекции вводили 33 мкг сфингомиелина или церамида в составе липосом на 100 г массы тела животного. При выборе дозы введения используемых препаратов руководствовались литературными данными о гепатотропных эффектах липидов в составе липосом [Cullis P.R., 1996]. Введение липосом осуществляли на 3 и 4 неделе от начала индукции гепатоцеллюлярной карциномы с интервалом в один день (всего 7 инъекций), что соответствовало раннему периоду канцерогенеза [Антониенко С.Г. и др., 1990]. Исследование изучаемых показателей проводили на 2,4,5,8,12 неделю, считая с момента начала введения канцерогена. На каждом этапе эксперимента было использовано по 6 животных в каждой группе. На протяжении исследований смертность животных составила 9%.
Содержание сфингомиелина, церамида и сфингозина в печени оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Экстракцию липидов проводили по Folch (1957). Хроматограммы окрашивали спиртовым раствором 10% фосфорномолибденовой кислоты с последующим сканированием и оценкой фракций с помощью программы "Chrom 3.1" для Windows.
Активность фосфолипазы А2 (ФЛА2) определяли по прибыли лизофосфатидной кислоты методом ТСХ (Brokerhoff H., 1978).
Активность фосфолипазы D (ФЛD) определяли по количеству фосфатидной кислоты методом ТСХ (Вагина О.Н., 1995).
Определение содержания ТБК-активных продуктов в печени осуществляли в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу Yagi K. (1976). Активность каталазы определяли по методу Королюк М.А. (1988).
Регистрацию апоптоза гепатоцитов осуществляли по анализу фрагментации ДНК (Орлов С.Н., 1987).
Фосфатидилхолин для приготовления липосом получали из куринных яичных желтков по методу Е.М. Краснопольского (1999). Липосомы получали по методу Г.Грегориадиса (1983). Липосомы состояли из фосфатидилхолина с добавлением липосомального буфера (145мМ NaCl, 10мМ трис HCl, рН 7.4), содержащего 0,2 мг/мл церамида или сфингомиелина ("Sigma Aldrich", США). В липосомы включалось до 65% церамида или сфингомиелина, что было показано методом ТСХ.
Статистическую обработку результатов производили с использованием пакета статистических программ "STATISTICA 6.0". Межгрупповые различия оценивали с использованием критерия Манна-Уитни. Проверка достоверности различий показателей в группе на разных этапах исследований проводилась с применением критерия парных сравнений Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В эксперименте на крысах нами была исследована роль компонентов сфингомиелинового цикла в развитии экспериментального рака печени, индуцированного N-диэтилнитрозамином. Наблюдение проводили в ходе курсового введения компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелина или церамида) в составе липосом.
Формирование гепатоцеллюлярного рака у крыс наблюдалось к концу четвертой недели после начала его индукции. При этом было установлено повышение активности каталазы в печени экспериментальных животных на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза в 2,9 и 3,2 раза, соответственно (p <0,05) (рис. 1). Показано, что высокая активность каталазы способствует резистентности клеток к апоптозу [Bai J., Cederbaum A.I., 2003], что и было нами продемонстрировано (рис.2).





При повышении активности каталазы должно происходить снижение количества перекиси водорода, в том числе и перекисей липидов. Однако содержание ТБК-активных продуктов в печени животных на второй и четвертой неделях развития гепатоцеллюлярного рака было повышенным (в 2,4 раза, p <0,05) (рис. 3). Однонаправленные изменения активности каталазы и содержании ТБК-активных продуктов в печени крыс (их повышение) в указанные сроки исследования могут быть обусловлены тем, что при развитии рака печени, индуцированного N-диэтилнитрозамином, наряду с увеличением количества перекиси водорода происходит повышение содержания и других активных форм кислорода, стимулирующих процессы ПОЛ [Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В., 2000]. Соответственно, интенсивность процессов липопероксидации на данном этапе может определяться функциональной активностью других ферментов антирадикальной защиты, исследование которых нами не проводилось.
Более выраженная активация каталазы в печени крыс (рис. 1) на пятой и восьмой неделях гепатоканцерогенеза сопровождалась нормализацией содержания ТБК-активных продуктов (рис. 3) к пятой неделе исследований с последующим снижением их количества (на 19%) к двенадцатой неделе эксперимента. Снижение количества ТБК-активных продуктов к двенадцатой неделе индукции рака может быть обусловлено уменьшением количества ненасыщенных жирных кислот, являющихся субстратом для процессов ПОЛ, в динамике гепатоканцерогенеза.



Известно, что перекисный механизм повреждения липидов тесно связан с действием фосфолипаз. Окисленные фосфолипиды легче подвергаются гидролизу фосфолипазами, а они, в свою очередь, делают липиды более доступными для свободнорадикального окисления [Дудник Л.Б., 2000].
Активность фосфолипазы D в ходе развития гепатоцеллюлярного рака увеличивалась (рис. 4), превышая показатели контрольной группы животных к двенадцатой неделе наблюдений в 3,4 раза (p < 0,05). При гидролизе фосфатидилхолина фосфолипазой D образуется фосфатидная кислота, которая участвует передаче сигнала через каскад MAP-киназ и способствует опухолевой прогрессии [Foster D, 2003].



Однако лизофосфатидная кислота, которая образуется из фосфатидной под действием фосфолипазы А2 оказывает более выраженное стимулирующее влияние на интенсивность процессов малигнизации по сравнению со своим предшественником [Грибанов Г.А., 1991; Eder A., Sasagawa T., Mao M. et al., 2000]. В динамике гепатоканцерогенеза наблюдалось стабильное увеличение активности фосфолипазы А2 в печени животных (рис. 5) с превышением данного показателя у крыс контрольной группы к двенадцатой неделе эксперимента в 2 раза (p < 0,05).



Активация фосфолипаз и перекисного окисления может явиться существенным моментом в изменении содержания липидов. В нашем исследовании показано, что содержание сфингомиелина в первые четыре недели индукции гепатоканцерогенеза не отличалось от показателей контрольной группы (рис. 6). В дальнейшем наблюдалось увеличение количества сфингомиелина в печени крыс данной группы с пятой по двенадцатую недели с превышением показателей группы контроля в 1,3 - 1,5 раза (p < 0,05).



Содержание церамида в печени животных в динамике канцерогенеза было сниженным (рис. 7). Следует отметить, что, начиная с пятой недели наблюдений снижение количества данного компонента цикла сфингомиелина было менее выраженным по сравнению с предыдущими сроками исследований, и к двенадцатой неделе содержание церамида достигало уровня контрольной группы животных. При этом содержание сфингозина (рис. 8) в динамике канцерогенеза изменялось неоднозначно: повышалось на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза (в 1,5 и 1,2 раза, соответственно, p < 0,05) и снижалось к восьмой и двенадцатой неделям наблюдений (в 1,2 и 1,3 раза, p < 0,05).





В следующей части работы проведено исследование влияния сфингомиелина и церамида, введенных в составе липосом, на развитие экспериментального гепатоцеллюлярного рака. Введение "пустых" липосом на фоне индукции рака печени не приводило к значимым изменениям морфологической картины печени крыс, содержания компонентов сфингомиелинового цикла (рис. 9, 10, 11), ТБК-активных продуктов (рис. 14), активности каталазы (рис. 12), фосфолипаз А2 и D (рис. 15, 16) и интенсивности процесса апоптоза (рис. 13). Следовательно, можно исключить непосредственное участие фосфатидилхолина, составляющего структуру липосом, в реализации эффектов сфингомиелина или церамида, введенных на фоне индукции гепатоканцерогенеза у крыс.
Воздействие на раковый процесс путем курсового введения липосом, нагруженных сфингомиелином приводило, по данным морфологического анализа ткани печени, к смещению во времени (до пятой недели наблюдений) этапа формирования раковых очагов. Церамид способствовал более выраженному, по сравнению со сфингомиелином, снижению интенсивности процесса малигнизации в печени.
Введение липосом, нагруженных компонентами сфингомиелинового цикла, на фоне развития гепатоклеточной карциномы приводило к увеличению содержания сфингомиелина и церамида в печени экспериментальных животных (рис. 9, 10).
Церамид обладает антипролиферативным действием, а также является индуктором апоптоза [Hannun Y.A.. 1996; Nilsson A., 2006; Taha T., 2004]. Однако при введении липосом, нагруженных сфингомиелином, в динамике гепатоканцерогенеза этап формирования морфологических признаков гепатоцеллюлярной карциномы всего лишь сдвигался во времени. Следовательно, увеличение периода хронического воспаления, предшествующего появлению признаков гепатоцеллюлярного рака, может быть обусловлено повышенным содержанием сфингозина на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза в период введения липосом (рис. 11). Это связано с тем, что сфингозин, как и церамид, способен оказывать стимулирующее влияние на процесс апоптоза, однако действует в меньших концентрациях [Алесенко А.В., 1998].
В дальнейшем, содержание сфингозина у крыс, которым вводили сфингомиелин в составе липосом, снижалось, составляя к двенадцатой неделе наблюдений 73% от показателей группы контроля.



Рис. 9. Содержание сфингомиелина (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных ("пустых") липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе);
b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).




Рис. 10. Содержание церамида (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных ("пустых") липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).





Рис. 11. Содержание сфингозина (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных ("пустых") липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).

Наиболее выраженное снижение интенсивности процесса малигнизации в печени установлено при введении липосом, нагруженных церамидом. Снижение интенсивности гепатоканцерогенеза в данной группе животных, скорее всего, связано с повышением содержания сфингозина в печени животных до четвертой недели наблюдений (рис. 11) и последующим наиболее выраженным по сравнению с остальными группами увеличением содержания церамида с четвертой по двенадцатую недели эксперимента (рис. 10).
Изменение содержания компонентов сфингомиелинового цикла в печени животных в результате их введения в составе липосом сопровождалось менее выраженной активацией каталазы в динамике канцерогенеза (рис. 12).



Рис. 12. Активность каталазы (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных (пустых) липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).


Введение в динамике индукции рака печени у крыс сфингомиелина или церамида в составе липосом, приводило к активации процесса апоптоза к четвертой неделе эксперимента (конец периода введения липосом) (рис.13). Следует подчеркнуть, что максимальная стимуляция процесса апоптоза (в 4,6 раза, p<0,05) на данном этапе исследований наблюдалась у крыс, которым вводили липосомы, нагруженные церамидом. К двенадцатой неделе эксперимента активность процессов апоптоза в печени животных, которым проводили инъекции липосомами, нагруженными сфингомиелином, снижалась, однако оставалась в 1,8 раза выше соответствующего показателя в группе с развитием рака печени без проводимой коррекции липосомами (p<0,05). При этом активность процесса апоптоза на данном этапе исследований у крыс, которым на фоне индукции рака печени вводили липосомы, содержащие церамид, оставалась повышенной, превышая показатели контрольной группы в 3,3 раза (p<0,05).



Рис. 13. Активность процесса апоптоза клеток печени крыс (в % от показателей контрольной группы) при введении не нагруженных (пустых) липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).


Изменения активности процесса апоптотической гибели гепатоцитов при введении липосом, нагруженных компонентами сфингомиелинового цикла, сопровождались изменениями в содержании ТБК-активных продуктов в печени животных (рис. 14). Введение сфингомиелина или церамида в составе липосом способствовало менее выраженному повышению количества указанных продуктов ПОЛ к четвертой неделе наблюдений с последующим более значимым снижением их содержания к пятой неделе эксперимента. Однако к восьмой неделе гепатоканцерогенеза содержание ТБК-активных продуктов в печени животных, которым проводили инъекции липосом, нагруженных сфингомиелином, достигало величины показателей группы с развитием гепатоцеллюлярного рака без проводимого введения липосом. Следует отметить, что наибольшее уменьшение количества данных продуктов ПОЛ с пятой по двенадцатую недели исследований наблюдалось при введении липосом, нагруженных церамидом.



Рис. 14. Содержание ТБК - активных продуктов (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных (пустых) липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).


Введение липосом, нагруженных компонентами сфингомиелинового цикла, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака приводило к снижению активности фосфолипазы А2 к концу четвертой недели после начала индукции гепатоцеллюлярной карциномы (рис. 15). В дальнейшем наблюдалось повышение активности фосфолипазы А2 в печени крыс данных групп к двенадцатой неделе исследований, которое однако было менее выраженным по сравнению с показателями группы крыс с развитием рака печени без проводимого введения липосом. Следует отметить, что активация данного энзима при введении на фоне гепатоканцерогенеза липосом, нагруженных церамидом, к двенадцатой неделе исследований была наименьшей.
При введении в динамике гепатоканцерогенеза липосом, нагруженных компонентами цикла сфингомиелина, было выявлено снижение активности фосфолипазы D к четвертой неделе исследований по сравнению с группами крыс с индукцией гепатоканцерогенеза без проводимой коррекции липосомами (рис. 16). Следует отметить, что наибольший угнетающий эффект на активность фермента оказывало введение липосом, содержащих церамид. К двенадцатой неделе наблюдений происходила активация фосфолипазы D в печени животных, которым на фоне индукции рака печени вводили компоненты сфингомиелинового цикла в составе липосом. Однако повышение активности фермента в печени крыс данных групп на этом этапе исследований было менее выраженным по сравнению показателями группы животных с индукцией гепатоцеллюлярной карциномы без проводимого введения липосом.



Рис. 15. Активность фосфолипазы А2 (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных (пустых) липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).




Рис. 16. Активность фосфолипазы D (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных (пустых) липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы
Примечание: a - p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b - p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c - p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением "пустых" липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f - p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).

Введение церамида на фоне индукции гепатоканцерогенеза обеспечивало наименьшую активацию фосфолипазы D в печени животных к двенадцатой неделе эксперимента.

ВЫВОДЫ
1. Развитие экспериментальной гепатоцеллюлярной карциномы у крыс характеризуется увеличением в ткани печени уровня сфингомиелина и снижением содержания церамида на всех этапах наблюдения (2 - 12 недели эксперимента). Повышение содержания сфингозина на начальных этапах гепатоканцерогенеза (2 - 4 недели исследований) сменяется его снижением к моменту формирования признаков рака печени и цирроза (8 - 12 недели).

2. В процессе формирования гепатоцеллюлярного рака у крыс содержание ТБК - активных продуктов в ткани печени на начальных этапах развития рака превышает показатели интактных животных в 2,5 раза, а к моменту появления морфологически выраженных признаков рака и цирроза печени уровень ТБК - активных продуктов снижается до 72%. Эти сдвиги сопровождаются стабильным увеличением активности каталазы в печени крыс.

3. В процессе гепатоканцерогенеза у крыс наблюдается увеличение активности фосфолипаз А2 и D. Введение на фоне развития рака печени липосом, нагруженных сфингомиелином или церамидом, приводит к снижению активности этих ферментов до уровня активности фосфолипаз А2 и D в группе интактных животных лишь к моменту окончания курсового введения липосом (4 неделя эксперимента).

4. Курсовое введение на фоне развития рака печени липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, приводит к выраженному повышению содержания в ткани печени сфингомиелина и церамида при параллельном снижении уровня сфингозина. Эти сдвиги сопровождаются снижением активности каталазы и уменьшением содержания ТБК - активных продуктов.

5. Введение липосом, нагруженных церамидом, в динамике развития гепатоцеллюлярного рака способствует более выраженному по сравнению с введением липосом, содержащих сфингомиелин, повышению содержания церамида и менее значимому увеличению уровня сфингомиелина, что сопровождается снижением уровня ТБК - активных продуктов, активности каталазы, фосфолипаз А2 и D.

6. Церамид, введенный в составе липосом на фоне развития гепатоцеллюлярного рака, способствует более выраженному, по сравнению со сфингомиелином, снижению интенсивности процесса малигнизации печени в результате понижения степени выраженности хронического воспаления и фиброза гепатоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Функциональная активность сфингомиелинового цикла при развитии хронического воспаления и рака печени у крыс // Сборник статей, посвященный 25-летию факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов (Томск 2004) с. 176-179 (в соавторстве с Заварзиным В.А., Новицким С.В., Серебровым В.Ю)
2. Влияние сфингомиелина и церамида на уровень пролиферации и индукции апоптоза клеток аденокарциномы Эрлиха // Сборник научных работ " Актуальные проблемы биологии медицины и экологии" (Томск 2004) - N3. - 2004. - стр.105 (в соавторстве с Заварзиным В.А., Вавилкиным Д.А., Серебровым В.Ю)
3. Компоненты сфингомиелинового цикла печени в динамике развития токсического CCL4 гепатита у крыс // Там же - стр.77 (в соавторстве с Заварзиным В.А., Новицким С.В., Вавилкиным Д.А., Серебровым В.Ю)
4. Активность сфингомиелиназы и церамидазы при хроническом воспалении и гепатоцеллюлярном раке печени крыс // Бюллетень Сибирской медицины-2005г, Приложение №1, стр. 113 (в соавторстве с Заварзиным В.А., Пурликом И.Л., Серебровым В.Ю)
5. Морфофункциональное состояние печени при введении нагруженных сфингомиелином или церамидом липосом на фоне токсического гепатита крыс // Бюллетень Сибирской медицины-2005г, №3, стр. 34-37. (в соавторстве с Заварзиным В.А., Пурликом И.Л., Новицким С.В., Серебровым В.Ю)
6. Роль компонентов сфингомиелинового цикла в воспалительном процессе ткани печени крыс на фоне введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид // Сборник научных работ "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень 2005)- стр.107-109. (в соавторстве с Заварзиным В.А., Пурликом И.Л., Серебровым В.Ю)
7. A regulation of sphingomyelin lipid cycle by the liposomes treatment at the rats having experimental hepatitis //7th Korea - Russia International Symposium of Science and Technology (2003 - june 28-july 6, Ulsan, Republic of Korea) - P.53-57. (в соавторстве с Серебровым В.Ю, Новицким С.В., Новицкой Т.В., Вавилкиным Д.А.)
8. The effects of sphingomyelin or ceramide loaded liposomes introduction to the rats having experimental toxic CCl4 hepatitis // eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases (8th international conference, 2003 September 7-10, Chicago) - P.138. (в соавторстве с Серебровым В.Ю, Новицким С.В., Заварзиным Д.А., Вавилкиным Д.А.)
9. Resault of the various ratio a sphingomyelin / ceramide action on a proliferation and apoptosis of the Ehrlich ascitic cancer cells // Там же - P.140. (в соавторстве с Серебровым В.Ю, Новицким С.В., Заварзиным Д.А., Кондаковой И.В., Вавилкиным Д.А.)
10. The content of a sphingomyelin and ceramide in a biopsy of liver tissue of the patient having the chronic virus hepatitis // Там же - P.143. (в соавторстве с Вавилкиным Д.А., Новицким С.В., Заварзиным В.А., Серебровым В.Ю)
11. A role of sphingomyelin lipid circle components in inflammation process caused by CCl4 at rats liposomes loaded by sphingomyelin or ceramide administed // // 8th Korea - Russia International Symposium of Science and Technology (2004 - june 28-july 6, Tomsk, Russia) - P.357-361. (в соавторстве с Серебровым В.Ю., Новицким С.В., Заварзиным В.А., Вавилкиным Д.А.)
12. Participation of sphingomyelin lipid cycle at inflammation // Recent advances in lipid metabolism and related disorders (FEBS workshop №05-28W, 2005, June 21-24, Dijon, France) (в соавторстве с Серебровым В.Ю., Пурликом И.Л., Заварзиным В.А.)
13. The content of sphingomyelin, ceramide and sphingosine in rats liver with hepatocellular carcinoma and chronic inflammation // eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases (9th international conference, 2005 September 11-14, San Francisco) - P.163. (в соавторстве с Серебровым В.Ю., Заварзиным В.А., Пурликом И.Л., Новицким С.В.)
14. The activity of sphingomyelinase, ceramidase and phospholipase A2 in rats liver with chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma // Там же - P.177. (в соавторстве с Заварзиным В.А., Пурликом И.Л., Серебровым В.Ю.)
15. Action of liposomes loaded by sphingomyelin or ceramide on proliferation and apoptosis of experimental hepatocellular carcinoma // Там же - P.178. (в соавторстве с Заварзиным В.А., Кокуриной Г.В., Серебровым В.Ю.)
??

??

??

??







5





СОДЕРЖАНИЕ